聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的荧光银染色

这是一种新型的凝胶染色方法，利用氟化银探针将传统的银染色转化为荧光银染色。与传统的硝酸银染色和SYPRO Ruby染色相比，该方法的性能有所提高，同时使用简单明了的不无醛化剂的协议。演示这个程序的将是AlexWong，一个来自我实验室的研究助理。

要开始此过程，请用含有蒸馏水、LDS 缓冲液和样品还原剂的溶液稀释蛋白质样品。设置一个装满 MES 缓冲液的迷你凝胶罐，使用 4-12% 的 Bis-Tris 蛋白凝胶执行 SDS-PAGE。用准备好的蛋白质样品装载油井，然后以200伏的恒定电压运行凝胶30分钟。

电泳后，将凝胶淹没在含有乙醇和醋酸的100毫升溶液中，在轨道摇床上孵育两次，每次在室温下孵育30分钟，同时在50转/时摇动。接下来，用超纯水在干净的容器中清洗凝胶三次，每次洗涤持续10分钟。首先，将0.01克硝酸银溶解在10毫升的超纯水中，以准备浓度为0.1%的库存溶液，将100微升的库存溶液加入100毫升的超纯水中，使硝酸银成为工作溶液。

在烟罩中，将凝胶淹没在 100 毫升的硝酸银工作溶液中，放在密封的玻璃室中。使用铝箔保护凝胶在浸渍期间免受光线影响，并在轨道摇床上以 50 rpm 转速摇晃时孵育一小时。之后，用超纯水在干净的容器中清洗凝胶两次，每次洗涤使用约100毫升的水，持续60秒。

在银浸渍步骤后，使用超纯水清洁凝胶非常重要，以尽量减少背景染色。首先，在3毫克TPE-4TA染料中加入50毫升的超纯水。在每次声波处理会话之间对溶液进行三分钟的声波化，并添加五升一摩尔氢氧化钠溶液，以帮助溶解染料，通常多达三次。

然后在 365 纳米紫外线灯下检查溶液的荧光，确保染料完全溶解。只有弱或非发射解决方案才表示完全溶解。为了准备氟原化开发溶液，在90毫升超纯水中加入10毫升的TPE-4TA库存溶液。

使用 pH 计检查溶液的 pH 值。使用稀释的氢氧化钠溶液或醋酸（如果pH值超过范围）将溶液调整为7至9之间的pH值。接下来，将凝胶转移到一个清洁和密封的容器中，其含 100 毫升的氟化开发溶液，并确保凝胶完全浸入。

密封容器并盖住容器，防止其发光。在转速为 50 rpm 且室温下在轨道摇床上摇动容器过夜。将凝胶转移到一个干净的容器中，在100毫升10毫升的10%乙醇中脱盐30分钟。

然后在超纯水中冲洗凝胶五分钟。凝胶可以在台式透光器上可视化，或在 365 纳米通道或 302 纳米通道的凝胶文档机器上成像。本研究采用一种新型荧光银染色方法染色聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。

荧光银污渍染色的蛋白质带在365纳米的紫外线灯下呈现出强烈的绿色。所有 14 个蛋白波段都清晰可见，并且与 SYPRO Ruby 染料染色的红颜色带关联良好。这种荧光银染色方法似乎有高分辨率。

对于某些蛋白带，荧光银染色的灵敏度也略好于荧光SYPRO Ruby染色的灵敏度。特别是这种染色的性能在10至40千吨之间的蛋白质带得到了改善，这表明新方法对于检测分子量低的蛋白质特别有用。从可以看到，数据还表明，荧光银染色在相对广泛的蛋白质定量范围内，为所有14种蛋白质提供了良好和均匀的线性度。

虽然硝酸银染色提供了高水平的背景信号和扭曲的峰值，但荧光银染色检测到的带子具有良好的对比度和均匀的强度分布，可在所有 14 种蛋白质上与 SYPRO Ruby 染色相媲美。洗涤步骤很重要，因为它们限制了残留固定溶液，扰乱了银浸渍或氟原源发育。使用硝酸银时，避免皮肤接触。

立即清除任何溢出物。穿防护服和手套，作为化学废物处理。