צביעת כסף פלורסנט של חלבונים בג'לים לזיהוי

זוהי שיטה חדשנית להכתמת ג'ל שמשתמשת בגשוש כסף פלואורוגני כדי להמיר את כתמי הכסף המסורתיים לכתמי כסף פלואורסצנטיים. שיטה זו הראתה ביצועים משופרים בהשוואה לכתמי חנקת כסף קונבנציונליים וכתמי רובי SYPRO תוך שימוש בפרוטוקול פשוט וישיר ללא אלדהידים. הדגמת ההליך תהיה אלכס וונג, עוזר מחקר מהמעבדה שלי.

כדי להתחיל בהליך זה, לדלל את דגימות החלבון עם פתרון המכיל מים מזוקקים, מאגר LDS, וסוכן להפחתת מדגם. הגדר מיכל ג'ל מיני מלא חיץ MES לבצע SDS-PAGE עם 4-12% ג'ל חלבון ביס-טריס. לטעון את בארות עם מדגם חלבון מוכן, ולאחר מכן להפעיל את הג'ל במתח קבוע של 200 וולט במשך 30 דקות.

לאחר אלקטרופורזה, מטביעים את הג'ל בתמצית של 100 מיליליטר המכילה אתנול וחומצה אצטית על שייקר מסלולית ודגירה פעמיים במשך 30 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר תוך כדי רעידות ב-50 סל"ד. לאחר מכן, לשטוף את הג'ל שלוש פעמים עם מים אולטרה-חמים במיכל נקי עם כל שטיפה נמשך 10 דקות. ראשית, להמיס 0.01 גרם של חנקת כסף ב 10 מיליליטר של מים אולטרה חוץ כדי להכין פתרון מלאי עם ריכוז של 0.1% להוסיף 100 microliters של פתרון המניה לתוך 100 מיליליטר של מים אולטרה פים כדי להפוך את פתרון העבודה חנקתי כסף.

ברדס אדים, להטביע את הג'ל ב 100 מיליליטר של פתרון עבודה חנקתי כסף בתא זכוכית אטום. השתמש בנייר אלומיניום כדי להגן על הג'ל מפני אור במהלך ההסרה והדגירה במשך שעה אחת תוך טלטול ב 50 סל"ד על שייקר מסלולית. לאחר מכן, לשטוף את הג'ל פעמיים עם מים אולטרה-חמים במיכל נקי, כאשר כל שטיפה משתמשת בכ-100 מיליליטר מים ונמשך 60 שניות.

חשוב להשתמש במים אולטרה-חמים לניקוי הג'ל לאחר שלב ההפלה הכסוף כדי למזער את כתמי הרקע. ראשית, להוסיף 50 מיליליטר של מים אולטרה פים לשלושה מיליגרם של צבע TPE-4TA. Sonicate הפתרון במשך שלוש דקות ולהוסיף חמישה microliters של פתרון נתרן הידרוקסיד טוחנת אחת בין כל מפגש sonication כדי לעזור להמיס את הצבע, בדרך כלל עד שלוש פעמים.

לאחר מכן בדוק את הפלואורסצנטיות של הפתרון תחת מנורת UV 365 ננומטר כדי להבטיח כי הצבע מומס במלואו. רק פתרונות חלשים או לא פליטים מצביעים על פירוק מלא. כדי להכין את פתרון פיתוח פלואורוגניים, להוסיף 10 מיליליטר של פתרון מלאי TPE-4TA ל 90 מיליליטר של מים אולטרה פנורמיים.

השתמש במד pH כדי לבדוק את ה- pH של הפתרון. כוונן את הפתרון ל- pH בין 7 ל - 9, באמצעות פתרון הידרוקסיד נתרן מדולל או חומצה אצטית אם ה- pH נמצא מחוץ לטווח. לאחר מכן מעבירים את הג'ל למיכל נקי ואטום עם 100 מיליליטר של פתרון פיתוח פלואורוגני ומבטיחים כי הג'ל שקוע לחלוטין.

לאטום את המיכל ולכסות אותו כדי להגן עליו מפני אור. לנער את המיכל לילה על שייקר מסלולית ב 50 סל"ד ו בטמפרטורת החדר. מעבירים את הג'ל למיכל נקי ומעבירים אותו ל-100 מיליליטר של 10% אתנול למשך 30 דקות.

לאחר מכן שוטפים את הג'ל במים אולטרה-חמים במשך חמש דקות. ניתן לדמיין את הג'ל על טרנסילומינטור על הספסל או לדמיין אותו על מכונת תיעוד ג'ל בערוץ 365 ננומטר או בערוץ 302 ננומטר. במחקר זה, שיטת כתמי כסף פלואורסצנטי רומן משמש כתם חלבונים ג'ל פוליאקרילמיד.

רצועות החלבון המוכתמות בכתם הכסף הפלואורסצנטי מציגות ירוק עז תחת מנורת UV 365 ננומטר. כל 14 רצועות החלבון נראות בבירור ומתאימות היטב לרצועות בצבע אדום המוכתמות על ידי צבע רובי SYPRO. נראה שלשיטת הכתמת כסף פלואורסצנטי זה יש רזולוציה גבוהה.

עבור כמה להקות חלבון, הרגישות של כתם כסף פלואורסצנטי הוא גם קצת יותר טוב מזה של כתם SYPRO רובי פלואורסצנטי. בפרט הביצועים של כתם זה משופר עבור רצועות החלבון בין 10 ל 40 קילודלטון, אשר מציין כי השיטה החדשה שימושית במיוחד לגילוי חלבונים עם משקל מולקולרי נמוך. כפי שניתן לראות, הנתונים גם מראים כי כתם כסף פלואורסצנטי נותן ליניאריות טובה ואחידות עבור כל 14 חלבונים על פני מגוון רחב יחסית של כימות חלבון.

בעוד כתם החנקה הכסוף נתן רמה גבוהה של אות רקע ופסגות מעוותות, כתם הכסף הפלואורסצנטי זיהה את הרצועות עם ניגודיות טובה והפצה אחידה בעוצמה דומה לכתם רובי SYPRO על פני כל 14 החלבונים. צעדי כביסה חשובים כפי שהם מגבילים את פתרון קיבוע שיורית משבשת חדירת כסף או התפתחות פלואורוגנית. בעת שימוש בחנקת כסף, יש להימנע ממגע בעור.

לנקות את כל השפכים באופן מיידי. ללבוש ביגוד מגן וכפפות ולהיפטר כמו פסולת כימית.