Il s’agit d’une nouvelle méthode de coloration du gel qui utilise une sonde fluorogène en argent pour convertir la coloration traditionnelle en argent en colorant en argent fluorescent. Cette méthode a montré des performances améliorées par rapport à la coloration conventionnelle de nitrate d’argent et la coloration rubis SYPRO tout en utilisant un protocole simple et simple sans aldéhydes. Alex Wong, assistant de recherche de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Pour commencer cette procédure, diluer les échantillons de protéines avec une solution contenant de l’eau distillée, tampon LDS, et un agent réducteur d’échantillons. Installez un mini réservoir de gel rempli de tampon MES pour effectuer SDS-PAGE avec un gel protéique Bis-Tris de 4 à 12 %. Chargez les puits avec l’échantillon de protéines préparé, puis exécutez le gel à une tension constante de 200 volts pendant 30 minutes.
Après l’électrophoresis, submerger le gel dans une solution de 100 millilitres contenant de l’éthanol et de l’acide acétique sur un shaker orbital et incuber deux fois pendant 30 minutes chacun à température ambiante tout en secouant à 50 rpm. Ensuite, lavez le gel trois fois avec de l’eau ultrapure dans un récipient propre avec chaque lavage d’une durée de 10 minutes. Tout d’abord, dissoudre 0,01 grammes de nitrate d’argent dans 10 millilitres d’eau ultrapure pour préparer une solution de stock avec une concentration de 0,1%Ajouter 100 microlitres de la solution de stock en 100 millilitres d’eau ultrapure pour faire la solution de travail nitrate d’argent.
Dans une hotte à vapeur, submerger le gel en 100 millilitres de la solution de travail au nitrate d’argent dans une chambre en verre scellé. Utilisez du papier d’aluminium pour protéger le gel de la lumière pendant l’imprégnation et incuber pendant une heure tout en secouant à 50 rpm sur un shaker orbital. Après cela, laver le gel deux fois avec de l’eau ultrapure dans un récipient propre, chaque lavage utilisant environ 100 millilitres d’eau et d’une durée de 60 secondes.
Il est important d’utiliser de l’eau ultrapure pour nettoyer le gel après l’étape d’imprégnation d’argent afin de minimiser les taches de fond. Tout d’abord, ajouter 50 millilitres d’eau ultrapure à trois milligrammes de teinture TPE-4TA. Sonicate la solution pendant trois minutes et ajouter cinq microlitres de solution hydroxyde de sodium une molaire entre chaque séance de sonication pour aider à dissoudre le colorant, généralement jusqu’à trois fois.
Vérifiez ensuite la fluorescence de la solution sous une lampe UV de 365 nanomètres pour vous assurer que le colorant est complètement dissous. Seules les solutions faibles ou non emissives indiquent une dissolution complète. Pour préparer la solution de développement fluorogène, ajoutez 10 millilitres de la solution de stock TPE-4TA à 90 millilitres d’eau ultrapure.
Utilisez un compteur de pH pour vérifier le pH de la solution. Accordez la solution à un pH entre 7 et 9, à l’aide d’une solution diluée d’hydroxyde de sodium ou d’acide acétique si le pH est hors de portée. Ensuite, transférez le gel dans un récipient propre et étanche avec 100 millilitres de la solution de développement fluorogène et assurez-vous que le gel est complètement immergé.
Scellez le récipient et couvrez-le pour le protéger de la lumière. Secouez le récipient pendant la nuit sur un shaker orbital à 50 rpm et à température ambiante. Transférer le gel dans un récipient propre et le détenir en 100 millilitres de 10% d’éthanol pendant 30 minutes.
Rincez ensuite le gel à l’eau ultrapure pendant cinq minutes. Le gel peut être visualisé sur un transilluminateur benchtop ou photographié sur une machine de documentation de gel au canal de 365 nanomètres ou au canal de 302 nanomètres. Dans cette étude, une nouvelle méthode fluorescente de coloration d’argent est employée pour tacher des protéines dans des gels de polyacrylamide.
Les bandes protéiques tachées par la tache d’argent fluorescent présentent un vert intense sous une lampe UV de 365 nanomètres. Les 14 bandes protéiques sont clairement visibles et sont bien corrélées avec les bandes de couleur rouge tachées par le colorant Rubis SYPRO. Cette méthode de coloration d’argent fluorescent semble avoir une haute résolution.
Pour certaines bandes protéiques, la sensibilité de la tache d’argent fluorescent est également légèrement meilleure que celle de la tache fluorescente SYPRO Ruby. En particulier, les performances de cette tache sont améliorées pour les bandes protéiques comprises entre 10 et 40 kilodaltons, ce qui indique que la nouvelle méthode est particulièrement utile pour la détection de protéines à faible poids moléculaire. Comme on peut le voir, les données suggèrent également que la tache d’argent fluorescent donne une bonne et uniforme linéarité pour les 14 protéines sur un éventail relativement large de quantification des protéines.
Tandis que la tache de nitrate d’argent a donné un niveau élevé de signal de fond et des crêtes déformées, la tache fluorescente d’argent a détecté les bandes avec le bon contraste et la distribution uniforme d’intensité comparable à la tache rubis de SYPRO dans les 14 protéines. Les étapes de lavage sont importantes car elles limitent la solution de fixation résiduelle de perturber l’imprégnation de l’argent ou le développement fluorogène. Lorsque vous utilisez du nitrate d’argent, évitez tout contact avec la peau.
Nettoyez immédiatement les déversements. Portez des vêtements et des gants de protection et éliminez-les sous forme de déchets chimiques.
