Questo è un nuovo metodo di colorazione del gel che utilizza una sonda d'argento fluorogenica per convertire la colorazione tradizionale dell'argento in una colorazione fluorescente in argento. Questo metodo ha mostrato prestazioni migliorate rispetto alla colorazione convenzionale del nitrato d'argento e alla colorazione SYPRO Ruby durante l'utilizzo di un protocollo semplice e diretto senza aldeidi. A dimostrare la procedura sarà Alex Wong, un assistente di ricerca del mio laboratorio.
Per iniziare questa procedura, diluire i campioni proteici con una soluzione contenente acqua distillata, tampone LDS e un agente riducente del campione. Impostare un mini serbatoio di gel riempito con buffer MES per eseguire SDS-PAGE con un gel proteico 4-12%Bis-Tris. Caricare i pozzi con il campione proteico preparato, quindi eseguire il gel a una tensione costante di 200 volt per 30 minuti.
Dopo l'elettroforesi, immergere il gel in una soluzione da 100 millilitri contenente etanolo e acido acetico su uno shaker orbitale e incubare due volte per 30 minuti ciascuno a temperatura ambiente mentre si trema a 50 giri/min. Successivamente, lavare il gel tre volte con acqua ultrapura in un contenitore pulito con ogni lavaggio della durata di 10 minuti. In primo luogo, sciogliere 0,01 grammi di nitrato d'argento in 10 millilitri di acqua ultrapura per preparare una soluzione stock con una concentrazione dello 0,1%Aggiungere 100 microlitri della soluzione stock in 100 millilitri di acqua ultrapura per rendere la soluzione di lavoro del nitrato d'argento.
In una cappa aspirante, immergere il gel in 100 millilitri della soluzione di lavorazione del nitrato d'argento in una camera di vetro sigillata. Utilizzare un foglio di alluminio per proteggere il gel dalla luce durante l'impregnazione e incubare per un'ora mentre si trema a 50 giri/min su uno shaker orbitale. Successivamente, lavare il gel due volte con acqua ultrapura in un contenitore pulito, con ogni lavaggio utilizzando circa 100 millilitri di acqua e della durata di 60 secondi.
È importante utilizzare acqua ultrapura per pulire il gel dopo la fase di impregnazione dell'argento per ridurre al minimo la colorazione dello sfondo. In primo luogo, aggiungere 50 millilitri di acqua ultrapura a tre milligrammi di colorante TPE-4TA. Sonicare la soluzione per tre minuti e aggiungere cinque microlitri di soluzione di idrossido di sodio un molare tra ogni sessione di sonicazione per aiutare a sciogliere il colorante, di solito fino a tre volte.
Quindi controllare la fluorescenza della soluzione sotto una lampada UV da 365 nanometri per assicurarsi che il colorante sia completamente sciolto. Solo soluzioni deboli o non emissive indicano la completa dissoluzione. Per preparare la soluzione di sviluppo fluorogenica, aggiungere 10 millilitri della soluzione stock TPE-4TA a 90 millilitri di acqua ultrapura.
Utilizzare un misuratore di pH per controllare il pH della soluzione. Sintonizzare la soluzione su un pH compreso tra 7 e 9, utilizzando soluzione diluita di idrossido di sodio o acido acetico se il pH è fuori portata. Successivamente trasferire il gel in un contenitore pulito e sigillabile con 100 millilitri della soluzione di sviluppo fluorogenica e assicurarsi che il gel sia completamente immerso.
Sigillare il contenitore e coprirlo per proteggerlo dalla luce. Agitare il contenitore durante la notte su uno shaker orbitale a 50 giri/min e a temperatura ambiente. Trasferire il gel in un contenitore pulito e trattenerlo in 100 millilitri di 10%etanolo per 30 minuti.
Quindi sciacquare il gel in acqua ultrapura per cinque minuti. Il gel può essere visualizzato su un transilluminatore da banco o immaginato su una macchina di documentazione in gel al canale di 365 nanometri o al canale di 302 nanometri. In questo studio, un nuovo metodo di colorazione fluorescente dell'argento viene utilizzato per macchiare le proteine nei gel di poliacrilammide.
Le bande proteiche macchiate dalla macchia d'argento fluorescente mostrano un verde intenso sotto una lampada UV da 365 nanometri. Tutte le 14 bande proteiche sono chiaramente visibili e si correlano bene con le bande di colore rosso macchiate dal colorante SYPRO Ruby. Questo metodo di colorazione fluorescente dell'argento sembra avere un'alta risoluzione.
Per alcune fasce proteiche, la sensibilità della macchia d'argento fluorescente è anche leggermente migliore di quella della macchia fluorescente SYPRO Ruby. In particolare, le prestazioni di questa macchia sono migliorate per le bande proteiche tra i 10 e i 40 kilodalton, il che indica che il nuovo metodo è particolarmente utile per l'individuazione di proteine a basso peso molecolare. Come si può vedere, i dati suggeriscono anche che la macchia d'argento fluorescente dà una linearità buona e uniforme per tutte le 14 proteine su una gamma relativamente ampia di quantificazione proteica.
Mentre la macchia di nitrato d'argento dava un alto livello di segnale di fondo e picchi distorti, la macchia d'argento fluorescente rilevava le bande con un buon contrasto e una distribuzione uniforme dell'intensità paragonabile alla macchia di rubino SYPRO in tutte le 14 proteine. Le fasi di lavaggio sono importanti in quanto limitano la soluzione di fissazione residua dall'interruzione dell'impregnazione dell'argento o dallo sviluppo fluorogenico. Quando si utilizza nitrato d'argento, evitare il contatto con la pelle.
Pulire immediatamente eventuali fuoriuscite. Indossare indumenti e guanti protettivi e smaltire come rifiuti chimici.
