利用高含量成像对增强细胞中的目标参与进行量化

该方法有助于回答化学生物学和药物发现中的关键问题。例如，你的化合物与目标蛋白质结合吗？该技术的主要优点是，对粘附细胞没有分离的要求。

空间定位可以通过成像确定。尽管我们已经在细胞系中应用了此方法，但也可以将此方法应用于其他细胞系统，如原培养物和共培养物。在播种细胞之前，将黑色384孔成像检测板放在组织培养罩中，并在使用标准钻头在每个板的两端打三个3.5毫米直径的孔之前用铝箔盖住板。

当板准备就绪时，使用无菌技术用 5 到 10 毫升 PBS 清洗 A-431 细胞培养。在37摄氏度下用两毫升的三辛细胞孵育，直到细胞分离。计数后，将细胞稀释至培养基中每毫升5倍至第4个细胞，并在每个检测板的每个井中播种40微升细胞。

播种后，从一侧轻轻摇动每个板，以确保细胞在井底的均匀分布。为了尽量减少板边缘效应，允许细胞在层流罩背面的室温下在检测板底部沉淀20分钟，然后将板置于定制加湿室中，在37摄氏度和5%的二氧化碳下放置两到三天。在实验当天，使用板垫圈从每一个井中吸气介质。

并在适当的实验井中加入30微升的息化合物，浓度适当。用透气板密封件密封经过复合处理的检测板。将板返回细胞培养箱30分钟。

要使细胞面临热挑战，首先将水浴设置为适当的实验温度，并在浴池中放置一个未密封的假板，该板包含与检测板相同体积的介质，以及用于监测水井内温度的热电偶温度计。当达到适当的实验温度时，从每个检测板上取下透气密封，用紧密的粘胶铝箔重新密封板，以确保水在水浴中随后加热时不会渗入井中。保持板架内的钻孔可访问。

将检测板和新的假板放入水浴中，板的底部向水面倾斜，以迫使板下剩余的空气，并开始监测新虚拟板的温度。板的均匀加热对于检测性能至关重要。小心把盘子放在水浴里，这样下面没有气泡。

三分钟后，立即将盘子用室温水第二水浴冷却五分钟，然后进行分析。要对细胞进行成像，首先将10微升16%的甲醛直接加入检测板，在室温下孵育20分钟。在固定期结束时，在板垫圈上用300微升PBS清洗细胞，并加入20微升0.1%NP40，在室温下孵育10分钟。

在孵育结束时，如证明的洗涤细胞。并在室温下用15微升1%牛血清白蛋白（BSA）阻断细胞1小时。接下来，使用板垫圈吸制阻断血清，并将感兴趣的原抗体的10微升加入适当的井中，在室温下孵育一小时。

在孵育结束时，用300微升PBS洗净每井，并在室温下用10微升适当的二次抗体标记细胞，在室温下一小时免受光线影响。对于细胞的核染色，在室温下，在每一个井中加入10微升适当的核染料10分钟。并清洗PBS中的细胞，如所证明的。

在室温下，每井用10微升的细胞掩码标记细胞，30分钟。接着是最后一次用 Pbs 洗。然后将 60 微升的新鲜 PBS 分配到每口井，然后用铝箔密封板，直到成像。

要对细胞进行成像，使用自动激光自动对焦的10倍目标下的适当荧光通道，在高含量成像仪上每井捕获四个图像，并在采集过程中应用装箱。然后将图像与元数据一起存储为 16 位灰度点 tiff 文件。抗体识别不应因配体结合引起的靶蛋白的构象变化而中断。

例如，BIRB796 具有很长的关闭率，只有应用抗原检索步骤，才能量化目标参与度。这种具有代表性的热聚集曲线实验，用于使用正向和负对照化合物处理的细胞，说明了在各种温度下用化合物处理细胞后的典型蛋白质稳定范围。这里展示了一个典型的等温剂量-反应指纹实验，以展示蛋白质稳定对不同剂量的实验化合物的反应的代表性范围。

应用等温热挑战进行化合物筛选，以识别靶蛋白的新粘结剂，允许在一次单一浓度下分析大量化合物，然后对命中的等温剂量-反应指纹进行识别，以确认目标蛋白稳定。在尝试此程序时，重要的是要记住，确切的实验条件，如热挑战的长度和温度，会影响化合物的观测效力。不要忘记，使用甲醛可能非常危险。

执行此程序时，应始终采取预防措施，例如遵循机构安全准则。