Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie chimique et la découverte de médicaments. Par exemple, votre composé se lie-t-il à la protéine cible? Les principaux avantages de cette technique sont qu’il n’y a pas besoin de détachement des cellules adhérentes.
Et la localisation spatiale peut être déterminée par imagerie. Bien que nous ayons appliqué cette méthode dans les lignées cellulaires, il est également possible d’appliquer cette méthode à d’autres systèmes cellulaires tels que les cultures primaires et les cocultures. Avant d’ensemencer les cellules, placez des plaques noires d’analyse d’imagerie de 384 puits dans un capot de culture tissulaire et recouvrez les plaques de papier d’aluminium avant d’utiliser une perceuse standard pour faire trois trous de 3,5 millimètres de diamètre aux deux extrémités de chaque plaque.
Lorsque les plaques sont prêtes, utilisez la technique aseptique pour laver une culture cellulaire A-431 avec 5 à 10 millilitres de PBS. Et incuber les cellules avec deux millilitres de trypsine à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules se détachent. Après comptage, diluer les cellules à 5 fois 10 à la 4ème cellule par millilitre dans le milieu de la culture, et les graines 40 microlitres de cellules à chaque puits de chaque plaque d’essai.
Secouer doucement chaque plaque d’un côté à l’autre après l’ensemencement pour assurer une distribution homogène des cellules à travers le fond du puits. Pour minimiser les effets du bord de la plaque, laissez les cellules s’installer au fond des plaques d’essai pendant 20 minutes à température ambiante à l’arrière du capot d’écoulement laminaire avant de placer les plaques dans une chambre humidifiée personnalisée pendant deux à trois jours à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le jour de l’expérience, utilisez une laveuse à plaques pour aspirer le milieu de chaque puits.
Et ajouter 30 microlitres du composé d’intérêt à la concentration expérimentale appropriée aux puits expérimentaux appropriés. Sceller les plaques d’analyse traitées au composé avec des joints de plaque respirants. Et retourner les plaques à l’incubateur de culture cellulaire pendant 30 minutes.
Pour exposer les cellules à un défi thermique, réglez d’abord le bain d’eau à la température expérimentale appropriée, et placez une plaque factice non scellée contenant le même volume de milieu par ainsi que la plaque d’analyse dans le bain, ainsi qu’un thermomètre thermocouple pour surveiller la température à l’intérieur des puits. Lorsque la température expérimentale appropriée a été atteinte, retirez le joint respirant de chaque plaque d’analyse et récellez les plaques avec une feuille d’aluminium adhésif étanche pour vous assurer qu’aucune eau ne s’écoule dans les puits pendant leur chauffage ultérieur dans le bain d’eau. Garder les trous percés dans le cadre de la plaque accessibles.
Placez les plaques d’analyse et une nouvelle plaque factice dans le bain d’eau, avec le fond des plaques inclinées vers la surface de l’eau pour forcer tout air restant sous les plaques, et commencer à surveiller la température de la nouvelle plaque factice. Un chauffage même de la plaque est essentiel pour les performances d’analyse. Prenez soin de placer la plaque dans le bain d’eau de sorte qu’il n’y ait pas de bulles d’air emprisonnées en dessous.
Après trois minutes, refroidir immédiatement les assiettes dans un deuxième bain d’eau à température ambiante pendant cinq minutes avant leur analyse. Pour imager les cellules, ajoutez d’abord 10 microlitres de 16% de paraformaldéhyde directement aux plaques d’essai pour une incubation de 20 minutes à température ambiante. À la fin de la période de fixation, laver les cellules avec 300 microlitres de PBS sur la laveuse de plaque, et ajouter 20 microlitres de 0,1%NP40 pour une incubation de 10 minutes à température ambiante.
À la fin de l’incubation, laver les cellules comme démontré. Et bloquer les cellules avec 15 microlitres de 1% d’albumine sérique bovine, ou BSA, pendant une heure à température ambiante. Ensuite, utilisez la laveuse à plaques pour aspirer le sérum bloquant et ajoutez 10 microlitres de l’anticorps primaire d’intérêt aux puits appropriés pour une incubation d’une heure à température ambiante.
À la fin de l’incubation, lavez chaque puits avec 300 microlitres de PBS, et étiquetez les cellules avec 10 microlitres de l’anticorps secondaire approprié pendant une heure à température ambiante protégée de la lumière. Pour la coloration nucléaire des cellules, ajouter 10 microlitres d’un colorant nucléaire approprié à chaque puits pendant 10 minutes à température ambiante. Et laver les cellules dans PBS comme démontré.
Étiquetez les cellules avec 10 microlitres de masque cellulaire par puits pendant 30 minutes à température ambiante. Suivi d’un dernier lavage avec PBS. Ensuite, distribuez 60 microlitres de PBS frais à chaque puits, et scellez les plaques avec du papier d’aluminium jusqu’à l’imagerie.
Pour imager les cellules, capturez quatre images par puits sur un imageur à haute teneur en utilisant les canaux fluorescents appropriés dans le cadre de l’objectif 10 fois à l’aide d’autofocus laser automatisé et appliquez le binning pendant l’acquisition. Ensuite, stockez les images sous forme de fichiers point-tiff gris 16 bitscale ainsi que les métadonnées. La reconnaissance des anticorps ne doit pas être perturbée par des changements conformationnels dans la protéine cible qui peuvent être induits par la liaison ligand.
Par exemple, birb796 a un taux de long terme, et la quantification de l’engagement cible n’est possible qu’en appliquant une étape de récupération des antigènes. Cette expérience représentative de courbe d’agrégation thermique pour les cellules traitées avec des composés de contrôle positifs et négatifs illustre les gammes typiques de stabilisation des protéines après le traitement des cellules avec les composés à différentes températures. Ici, une expérience typique d’empreinte digitale isothermale dose-réponse est montré pour démontrer des gammes représentatives de stabilisation des protéines en réponse à différentes doses de composé expérimental.
L’application de défis de chaleur isothermale pour le criblage composé pour identifier de nouveaux liants de la protéine cible permet l’analyse d’un grand nombre de composés à une seule concentration à la fois, avant l’empreinte isothermale dose-réponse des coups pour confirmer la stabilisation de protéine cible. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que les conditions expérimentales exactes, telles que la longueur et la température du défi thermique ont un impact sur la puissance observée des composés. N’oubliez pas que travailler avec du paraformaldéhyde peut être extrêmement dangereux.
Et des précautions, telles que le suivi des directives de sécurité institutionnelles, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
