Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в химической биологии и обнаружения наркотиков. Например, связывается ли ваше соединение с целевым белком? Основными преимуществами этой техники являются то, что нет необходимости отсоединения адептов клеток.
А пространственную локализацию можно определить с помощью изображений. Хотя мы применили этот метод в клеточных линиях, можно также применить этот метод к другим клеточным системам, таким как первичные культуры и кокультуры. Перед посевом клеток, место черный 384-хорошо изображений анализ пластин в ткани культуры капот, и покрыть пластины с алюминиевой фольгой, прежде чем использовать стандартную дрель, чтобы сделать три 3,5-миллиметрового диаметра отверстия на обоих концах каждой пластины.
Когда пластины будут готовы, используйте асептический метод для мытья культуры клеток A-431 с 5 до 10 миллилитров PBS. И инкубировать клетки с двумя миллилитров трипсина при 37 градусов по Цельсию, пока клетки отсоединиться. После подсчета, разбавить клетки до 5 раз от 10 до 4-го клетки на миллилитр в среде культуры, и семена 40 микролитров клеток к каждому хорошо каждой пластины анализа.
Аккуратно встряхивая каждую пластину из стороны в сторону после посева, чтобы обеспечить однородное распределение клеток по днищам хорошо. Чтобы свести к минимуму эффекты края пластины, позвольте клеткам осесть в нижней части анализных пластин в течение 20 минут при комнатной температуре в задней части капота ламинарного потока, прежде чем поместить пластины в специальной увлажненной камере в течение двух-трех дней при температуре 37 градусов по Цельсию и 5%углекислом газе. В день эксперимента используйте шайбу пластины, чтобы аспирировать среду из каждой хорошо.
И добавить 30 микролитров соединения интереса при соответствующей экспериментальной концентрации к соответствующим экспериментальным скважинам. Печать соединения обработанные анализные пластины с дышащий пластины уплотнения. И верните пластины в инкубатор клеточной культуры на 30 минут.
Чтобы подвергнуть клетки тепловой проблеме, сначала установите водяную баню до соответствующей экспериментальной температуры и поместите в ванну распечатанные манекены, содержащие тот же объем среды на а также анализную пластину, а также термоотесательный термометр для мониторинга температуры в колодцах. Когда соответствующая экспериментальная температура была достигнута, удалить дышащий уплотнение с каждой пластины анализа и запечатать пластины с жесткой клей алюминиевой фольги, чтобы убедиться, что нет утечки воды в скважины во время их последующего нагрева в водяной бане. Обеспечение безопасности просверленных отверстий в раме пластины.
Поместите анализные пластины и новую фиктивную тарелку в водяную баню, с дном пластин под углом к поверхности воды, чтобы заставить любой оставшийся воздух из-под пластин, и начать мониторинг температуры нового манекена пластины. Равномерное нагревание пластины имеет решающее значение для анализа производительности. Позаботьтесь, чтобы поместить тарелку в водяной бане так, что Есть нет пузырьков воздуха в ловушке под.
Через три минуты сразу охладим тарелки во второй водяной бане комнатной температурной воды за пять минут до их анализа. Чтобы изображение клеток, сначала добавить 10 микролитров 16%paraformaldehyde непосредственно в анализ пластин для 20-минутной инкубации при комнатной температуре. В конце периода фиксации, мыть клетки с 300 микролитров PBS на шайбу пластины, и добавить 20 микролитров 0,1%NP40 за 10-минутную инкубацию при комнатной температуре.
В конце инкубации, мыть клетки, как попродемонстрировано. И блокировать клетки с 15 микролитров 1%бычьего альбумин сыворотки, или BSA, в течение одного часа при комнатной температуре. Далее используйте шайбу пластины для аспирации блокирующей сыворотки и добавьте 10 микролитров первичного антитела, представляющих интерес для соответствующих скважин для часовой инкубации при комнатной температуре.
В конце инкубации, мыть каждый колодец с 300 микролитров PBS, и этикетки клеток с 10 микролитров соответствующих вторичных антител в течение одного часа при комнатной температуре защищены от света. Для ядерного окрашивания клеток добавьте 10 микролитров соответствующего ядерного красителя к каждому колодец в течение 10 минут при комнатной температуре. И мыть клетки в PBS, как попродемонстрировано.
Этикетка клеток с 10 микролитров клеточной маски на колодец в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем последняя стирка с PBS. Затем обойтись 60 микролитров свежего PBS для каждой хорошо, и печать пластин с алюминиевой фольгой до визуализации.
Чтобы изображение клеток, захватить четыре изображения на колодец на высоком содержании imager с помощью соответствующих флуоресцентных каналов под 10-раз цель с помощью автоматизированного лазерного автофокуса и применять binning во время приобретения. Затем храните изображения в качестве 16-битных серых файлов dot-tiff вместе с метаданными. Распознавание антител не должно нарушаться конформациальными изменениями в целевом белке, которые могут быть вызваны связыванием лигандов.
Например, BIRB796 имеет длительный показатель, и количественная оценка целевого взаимодействия возможна только путем применения шага поиска антигена. Этот репрезентативный эксперимент по кривой тепловой агрегации для клеток, обработанных положительными и отрицательными контрольным соединениями, иллюстрирует типичные диапазоны стабилизации белка после обработки клеток соединениями при различных температурах. Здесь показан типичный изотермальный эксперимент по отпечаткам пальцев на дозу, чтобы продемонстрировать репрезентативные диапазоны стабилизации белка в ответ на различные дозы экспериментального соединения.
Применение изотермальных тепловых проблем для соединения скрининга для выявления новых связующих целевых белков позволяет анализ большого количества соединений в одной концентрации в одно время, прежде чем изотермальная доза ответ дактилоскопии хитов для подтверждения стабилизации целевого белка. При попытке этой процедуры, важно помнить, что точные экспериментальные условия, такие как длина и температура тепла вызов воздействия наблюдаемой потенции соединений. Не забывайте, что работа с параформалдегидом может быть чрезвычайно опасной.
И меры предосторожности, такие как следовать институциональным руководящим принципам безопасности, всегда должны приниматься при выполнении этой процедуры.
