この方法は、化学生物学と創薬における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、あなたの化合物は標的タンパク質に結合しますか?この手法の主な利点は、接着細胞の剥離の要件が無いということです。
空間的な局在化はイメージングによって決定することができる。この方法は細胞株で適用しましたが、この方法を主要な培養物やコカルチャーなどの他の細胞系にも適用することも可能です。細胞を播種する前に、黒い384ウェルイメージングアッセイプレートを組織培養フードに入れ、標準ドリルを使用して各プレートの両端に3.5ミリメートルの直径の穴を作る前に、アルミニウム箔でプレートを覆います。
プレートの準備ができたら、無菌技術を使用して、5〜10ミリリットルのPBSでA-431細胞培養を洗浄します。そして、細胞が剥離するまで摂氏37度でトリプシンの2ミリリットルで細胞をインキュベートします。計数後、培養培地で1ミリリットル当たり4番目の細胞に5倍10~4番目の細胞を希釈し、各アッセイプレートの各ウェルに40マイクロリットルの細胞をシードする。
播種後の各プレートを左右に軽く振り、ウェルボトム全体の細胞の均質な分布を確保します。プレートエッジの効果を最小限に抑えるために、細胞が積層流フードの後ろの室温で20分間アッセイプレートの底に落ち着くようにしてから、プレートを摂氏37度と5%の二酸化炭素で2〜3日間カスタム加湿チャンバーに入れます。実験当日は、プレートワッシャーを使用して各ウェルから培地を吸引します。
そして、適切な実験井戸に適切な実験濃度で目的の化合物の30マイクロリットルを加える。合成処理アッセイプレートを通気性のあるプレートシールで密封します。そして、30分間細胞培養インキュベーターにプレートを戻す。
熱に挑戦する細胞を公開するには、まず、適切な実験温度に水浴を設定し、ウェル内の温度を監視するための温度温度計と一緒に、測定プレートと同様に同じ量の媒体を含む未密封のダミープレートを浴に入れます。適切な実験温度に達したら、各アッセイプレートから通気性シールを取り除き、密着した接着型アルミニウム箔でプレートを再密封して、その後の水浴の加熱中に井戸に水が漏れないようにします。プレートフレーム内のドリル穴をアクセス可能に保ちます。
プレートの底を水面に向けて傾けて、プレートの下から残りの空気を強制的に押し付け、新しいダミープレートの温度の監視を開始して、アッセイプレートと新しいダミープレートを水浴に入れます。プレートの加熱もアッセイの性能にとって重要です。下に閉じ込められた気泡がなさそうな水浴にプレートを置くように注意してください。
3分後、すぐに分析の前に5分間室温水の第二の水浴でプレートを冷却します。細胞を画像化するには、まず16%パラホルムアルデヒドの10マイクロリットルをアッセイプレートに直接加え、室温で20分間インキュベーションします。固定期間の終わりに、プレートウォッシャーに300マイクロリットルのPBSで細胞を洗浄し、室温で10分間インキュベーションするために0.1%NP40の20マイクロリットルを加えます。
インキュベーションの終わりに、実例のように細胞を洗浄する。そして、1%ウシ血清アルブミン、またはBSAの15マイクロリットルの細胞を室温で1時間ブロックします。次に、プレートワッシャーを使用してブロッキング血清を吸引し、目的の一次抗体の10マイクロリットルを適切なウェルに加え、室温で1時間のインキュベーションを行います。
インキュベーションの最後に、300マイクロリットルのPBSで各ウェルをよく洗い、適切な二次抗体の10マイクロリットルを光から保護した室温で1時間ラベル付けします。細胞の核染色の場合は、適切な核染料10マイクロリットルを室温で10分間各ウェルに加えます。そして、実証したようにPBSで細胞を洗浄する。
セルに1ウェルあたり10マイクロリットルのセルマスクを室温で30分間ラベル付けします。続いてPBSで最後の洗浄が行われた。その後、各ウェルに新鮮なPBSの60マイクロリットルを分配し、イメージングまでアルミニウム箔でプレートを密封します。
細胞を画像化するには、自動レーザーオートフォーカスを使用して10倍の目的で適切な蛍光チャネルを使用して高含有量イメージャー上のウェルあたり4つの画像をキャプチャし、取得中にビニングを適用します。次に、画像をメタデータと共に 16 ビットのグレースケールのドット tiff ファイルとして保存します。リガンド結合によって誘導され得る標的タンパク質の立体構造変化によって抗体認識が破壊されてはならない。
例えば、BIRB796は、長いオフレートを有し、かつ、抗原検索ステップを適用することによってのみ、標的関与の定量が可能である。陽性および陰性対照化合物で処理された細胞に対する本代表熱凝集曲線実験は、種々の温度での化合物での細胞の処理後の典型的なタンパク質安定化範囲を例示する。ここで典型的な等温線量応答指紋実験は、実験化合物の異なる用量に応答してタンパク質安定化の代表的な範囲を示すことを示す。
化合物スクリーニングのための等温熱課題を適用して、標的タンパク質の新規結合剤を同定することで、ヒットの等温線量応答フィンガープリントの前に、一度に1つの濃度で多数の化合物を分析し、標的タンパク質安定化を確認することができます。この手順を試みる間、熱の長さや温度などの正確な実験条件が化合物の観察力に影響を与えることを覚えておくことが重要です。パラホルムアルデヒドを使用すると非常に危険なことができますことを忘れないでください。
また、制度上の安全ガイドラインに従うなどの予防措置は、この手順を実行する際に必ず講じる必要があります。
