该方法有助于回答T细胞免疫学和病毒载体疫苗开发领域关键问题。这种方法的主要优点是只需要少量的血液，这允许从同一只小鼠重复测量。此外，可以从同一样本中检测病毒和转基因特异性CTL。
演示这个程序的将是贾莉·林诺夫纳，一个技术员，和安妮卡·罗斯勒，一个研究生。测量和分析样品将是佐尔坦银行，一个博士后。首先，根据文本协议安全地约束鼠标。
从小鼠的尾静脉收集 EDTA 涂层管中的 20 微升血液。当使用脾脏时，分离脾脏并使用注射器的柱塞通过细胞过滤器压组织。在对红细胞进行解解后，计算细胞并调整样品的浓度。
准备并标记每个样品的一个 Facs 管，并转移 100 微升的器官悬浮液，或 20 微升血液到管中。使用飞溅细胞时，将器官悬浮液离心五分钟，然后丢弃上经剂。然后，旋转管子重新暂停细胞颗粒。
对于要使用的每个通道，还要为补偿样品准备一个 Facs 管。将一个附加示例作为未污染的控件准备。准备一个管与Facs缓冲器与三角板在最佳稀释，和涡混合。
接下来，将50微升的四分之一稀释剂添加到每个样品中，并混合涡流。将不带三角板的 Facs 缓冲区添加到补偿控制和未污染的样品中。接下来，在37摄氏度的黑暗条件下孵育样品20分钟。
当样品孵育时，将筋膜缓冲液添加到管子中。然后，根据文本协议表2中指定的稀释法将抗体添加到缓冲液中，并旋转溶液。在科学问题上，除了此处描述的标记组合外，可以使用标记组合。
确保始终在面板中包含针对 CD3 和 CD8 的抗体。对于每个通道，准备一个管与200微升的Facs缓冲液，并添加一微升的抗体稀释对CD8在各自的颜色，和涡流混合。然后，存储文本协议中指定的抗体稀释液。
要清洗样品，请向样品和离心机添加一毫升的 Facs 缓冲液。然后，丢弃上清液，然后用纸巾排干剩余的液体。使用血液时，在排出剩余液体时要小心。
在红细胞解解之前，血液不会粘在管底。或者，你可以吸上一道。接下来，将50微升的抗体溶液加入每个细胞颗粒，轻轻涡流。
将每个补偿混合物的 50 微升添加到相应的补偿控制中，将 50 微升的 Facs 缓冲液添加到未污染对照的细胞颗粒中，并轻轻旋转。使用飞溅细胞时，用一到两毫升的Facs缓冲液直接洗涤样品，并离心五分钟。然后，丢弃上清液，将剩余的液体排干纸巾上的剩余液体。
在每个血液样本中加入500微升的CK缓冲液，轻轻旋转。然后，在黑暗中孵育样品5分钟，在室温下。向样品和离心机添加一毫升的 Facs 缓冲液。
然后，丢弃上流液，用纸巾排出剩余的液体。正确解切血球是促进筋膜测量的关键步骤，因此，当颗粒相当潮湿时，对红细胞重复解解。如前所述，再次清洗样品。
然后，丢弃上流液，将剩余的液体排入纸巾上。在固定之前，确保细胞被很好地重新暂停，以防止团的形成。将 150 到 300 微升的 Facs 固定缓冲液添加到每个管中，并混合涡流。
然后，尽快进行流量细胞测量。首先，测量补偿控制并纠正任何光谱重叠。之后，设置顺序门以选择 CD3 阳性和 CD8 阳性细胞。
使用正向和侧散射区对淋巴细胞的栅极。然后，在淋巴细胞群体中，使用正向散射宽度与面积对单细胞进行闸门。使用 CD3 和 CD8 通道绘制单细胞淋巴细胞。
通过对CD3阳性和CD8阳性细胞进行浇注，识别CD8阳性T细胞。确保浇注中包含 CD8 低细胞。在 CD3/CD8 阳性细胞上传播是此协议中的关键步骤。
由于细胞的激活往往导致CD3和/或CD8的调节下降，CD3/CD8低细胞也应该包括在内。在此之后，绘制CD8阳性细胞与四分之一细胞，在CD8阳性/四分之一阳性细胞上浇注。如果可能，在每个样本的 CD3 阳性和 CD8 阳性栅极中记录 20，000 个细胞。
最后，将测量值保存为 FCS 文件。在该协议中，在血液和组织样本中定量检测抗原特异性CD8+T细胞。在对CD3阳性和CD8阳性细胞进行浇注后，确定了四位阳性细胞。
在同一管中结合两种不同的三角板进行染色，允许同时定量两种不同的 CTL 特异性。使用此协议，同一只小鼠的 T 细胞响应可以随着时间的推移被跟踪，因为每次测量只需要少量血液。此外，还可以分析抗原特异性CTL的表型。
在尝试此程序时，必须避免长时间的孵育时间，因为这可能导致T细胞受体的内化。自从四元器技术发现以来，四角体染色已成为T细胞分析以及广泛应用的重要工具，其中包括四角板的积累。光明的三角的光明未来。
