Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie des cellules T et de la mise au point de vaccins vecteurs viraux. Le principal avantage de cette méthode est que seules de petites quantités de sang sont nécessaires, ce qui permet des mesures répétées de la même souris. En outre, des LTT spécifiques au virus et aux transgènes peuvent être détectés à partir du même échantillon.
Jasmine Rinnofner, technicienne, et Annika Rossler, étudiante diplômée, démontreront la procédure. Zoltan Banki, post-doc, mesurera et analysera les échantillons. Pour commencer, retenez une souris en toute sécurité selon le protocole de texte.
Recueillir 20 microlitres de sang dans un tube recouvert d’EDTA dans la veine arrière d’une souris. Lorsque vous travaillez avec des splenocytes, isolez la rate et utilisez le piston d’une seringue pour presser le tissu à travers une passoire cellulaire. Après avoir effectué une lyse sur les érythrocytes, comptez les cellules et ajustez la concentration de l’échantillon.
Préparer et étiqueter un tube Facs pour chaque échantillon, et transférer 100 microlitres de suspension d’organe, ou 20 microlitres de sang dans le tube. Lorsque vous travaillez avec des splenocytes, centrifuger la suspension de l’organe pendant cinq minutes, et jeter le supernatant. Ensuite, vortex le tube pour résuspendre la pastille cellulaire.
Pour que chaque canal soit utilisé, préparez également un tube Facs pour un échantillon de compensation. Préparez un échantillon supplémentaire comme un contrôle non taché. Préparer un tube avec des tampons Facs avec des tétramers à leurs dilutions optimales, et vortex à mélanger.
Ensuite, ajouter 50 microlitres de dilution du tétramer à chaque échantillon, et vortex à mélanger. Ajouter le tampon Facs sans tétramers aux contrôles de compensation et à l’échantillon non taché. Ensuite, incubez les échantillons dans des conditions sombres à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.
Pendant que les échantillons couvent, ajouter le tampon Facs à un tube. Ensuite, ajoutez les anticorps au tampon en fonction des dilutions spécifiées dans le tableau 2 du protocole de texte, et vortex de la solution. En attendant sur la question scientifique sont les combinaisons de marqueurs, en dehors de celui décrit ici, pourrait être utilisé.
Assurez-vous d’inclure toujours des anticorps contre le CD3 et le CD8 dans le panneau. Pour chaque canal, préparer un tube avec 200 microlitres de tampon Facs, et ajouter un microlitres d’une dilution d’anticorps contre CD8 dans leur couleur respective, et vortex à mélanger. Ensuite, stockez les dilutions d’anticorps telles que spécifiées dans le protocole texte.
Pour laver les échantillons, ajouter un mililiter de tampon Facs aux échantillons et à la centrifugeuse. Ensuite, jetez le surnatant et égouttez le reste du liquide avec des serviettes en papier. Lorsque vous travaillez avec du sang, soyez prudent lorsque vous drainez le liquide restant.
Avant la lyse des érythrocytes, le sang ne collera pas au fond du tube. Alternativement, vous pouvez aspirer le surnatant. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de la solution d’anticorps à chaque granule cellulaire, et vortex doucement.
Ajouter 50 microlitres de chaque mélange de compensation au contrôle de compensation correspondant, et 50 microlitres de tampon Facs à la pastille cellulaire du contrôle non taché, et vortex doucement. Lorsque vous travaillez avec des splenocytes, lavez les échantillons après la coloration des anticorps directement avec un à deux millilitres de tampon Facs, et centrifugeuse pendant cinq minutes. Ensuite, jetez le surnatant et égouttez le reste du liquide sur du papier absorbant.
Ajouter 500 microlitres de tampon ACK à chaque échantillon de sang, et vortex doucement. Ensuite, incuber les échantillons dans l’obscurité pendant cinq minutes à température ambiante. Ajouter un millilitre de tampon Facs aux échantillons et centrifugeuse.
Ensuite, jetez le supernatant et égouttez le reste du liquide avec des serviettes en papier. La lyse appropriée des érythrocytes est une étape cruciale pour faciliter la mesure de Facs, par conséquent, quand la pastille est plutôt humide, la lyse répétée des érythrocytes. Lavez les échantillons à nouveau comme décrit précédemment.
Ensuite, jetez le surnatant et égouttez le reste du liquide sur une serviette en papier. Avant la fixation, assurez-vous que les cellules sont bien résuspendées afin d’empêcher la formation de touffes. Ajouter 150 à 300 microlitres de tampon de fixation Facs à chaque tube, et vortex à mélanger.
Ensuite, procédez à la mesure cytométrique de flux aussi rapidement que possible. Tout d’abord, mesurez les contrôles de compensation et corrigez tout chevauchement spectral. Ensuite, installez des barrières séquentielles à sélectionner pour les cellules CD3 positives et CD8 positives.
Porte sur les lymphocytes à l’aide de la zone de dispersion vers l’avant et vers le côté. Puis, dans la population de lymphocytes, porte sur les cellules simples en utilisant la largeur de dispersion vers l’avant par rapport à la zone. Utilisez les canaux CD3 et CD8 pour tracer des lymphocytes unicellulaires.
Identifier les lymphocytes T CD8 positifs, en tétant sur les cellules CD3-positives et CD8-positives. Assurez-vous que les cellules CD8-low sont incluses dans le gating. La propagation sur les cellules CD3/CD8 positives est une étape critique de ce protocole.
Comme l’activation des cellules conduit souvent à une régulation vers le bas de CD3 et / ou CD8, CD3 / CD8-cellules basses devraient également être inclus. Après cela, tracer les cellules CD8-positives par rapport aux cellules tétramer, gating sur les cellules CD8-positive/tétramer-positive. Si possible, enregistrez 20 000 cellules dans la porte CD3-positive et CD8-positive pour chaque échantillon.
Enfin, enregistrez les mesures en tant que fichier FCS. Dans ce protocole, des lymphocytes CD8+T spécifiques aux antigènes ont été quantitativement détectés dans des échantillons de sang et de tissus. Après avoir tétras les cellules CD3-positives et CD8-positives, des cellules tétramer-positives ont été identifiées.
Deux tétramers différents ont été combinés dans le même tube pour la coloration, permettant la quantification simultanée de deux spécificités différentes de CTL. En utilisant ce protocole, les réponses des cellules T d’une même souris peuvent être suivies au fil du temps, car seules de petites quantités de sang sont nécessaires pour chaque mesure. En outre, des phénotypes de CTLs antigène-spécifiques peuvent être analysés.
Tout en essayant cette procédure, il est important d’éviter des temps d’incubation prolongés, car cela peut conduire à l’internalisation des récepteurs des cellules T. Depuis la découverte de la technologie du tétramer, la coloration du tétramer est devenue un outil essentiel pour l’analyse des cellules T, et un large éventail d’applications, y compris l’accumulation de tétramers. Un bel avenir pour les tétramers brillants.
