Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia delle cellule T e dello sviluppo di vaccini vettoriali virali. Il vantaggio principale di questo metodo è che sono necessarie solo piccole quantità di sangue, il che consente misurazioni ripetute dallo stesso topo. Inoltre, è possibile rilevare CCL specifici per virus e transgeni dallo stesso campione.
A dimostrare la procedura saranno Jasmine Rinnofner, una tecnico, e Annika Rossler, una studentessa laureata. A misurare e analizzare i campioni sarà Zoltan Banki, un post-doc. Per iniziare, trattenere in modo sicuro un mouse in base al protocollo di testo.
Raccogliere 20 microlitri di sangue in un tubo rivestito di EDTA dalla vena di coda di un topo. Quando si lavora con gli splenociti, isolare la milza e utilizzare lo stantuffo di una siringa per premere il tessuto attraverso un colino cellulare. Dopo aver eseguito lalisi sugli erytrociti, contare le cellule e regolare la concentrazione del campione.
Preparare ed etichettare un tubo Facs per ogni campione e trasferire 100 microlitri di sospensione d'organo o 20 microlitri di sangue nel tubo. Quando si lavora con gli splenociti, centrifugare la sospensione dell'organo per cinque minuti e scartare il supernatante. Quindi, vortice il tubo per rimosogliere il pellet cellulare.
Per ogni canale da utilizzare, preparare anche un tubo Facs per un campione di compensazione. Preparare un campione aggiuntivo come controllo non macchiato. Preparare un tubo con tamponi Facs con tetrameri alle loro diluizioni ottimali e vortice da mescolare.
Quindi, aggiungere 50 microlitri della diluizione tetramero a ciascun campione e vortice da mescolare. Aggiungere il buffer Facs senza tetrameri ai controlli di compensazione e al campione non macchiato. Successivamente, incubare i campioni in condizioni scure a 37 gradi Celsius per 20 minuti.
Mentre i campioni incubano, aggiungere il tampone Facs a un tubo. Quindi, aggiungere gli anticorpi al tampone in base alle diluizioni specificate nella tabella 2 del protocollo di testo e vortice la soluzione. In attesa della questione scientifica si potrebbero utilizzare le combinazioni marcatori, oltre a quella qui descritta.
Assicurarsi di includere sempre anticorpi contro CD3 e CD8 nel pannello. Per ogni canale, preparare un tubo con 200 microlitri di tampone Facs e aggiungere un microlitri di diluizione anticorpale contro CD8 nel rispettivo colore e vortice da mescolare. Quindi, conservare le diluizioni anticorpali come specificato nel protocollo di testo.
Per lavare i campioni, aggiungere un mililiter di tampone Facs ai campioni e alla centrifuga. Quindi, scartare il supernatante e scolare il liquido rimanente con gli asciugamani di carta. Quando si lavora con il sangue, essere cauti quando si drena il liquido rimanente.
Prima della lisi degli etitrociti, il sangue non si attacca al fondo del tubo. In alternativa, è possibile aspirare il supernatante. Quindi, aggiungere delicatamente 50 microlitri della soluzione anticorpale a ciascun pellet cellulare e vortice.
Aggiungere 50 microlitri di ogni miscela di compensazione al corrispondente controllo di compensazione e 50 microlitri di tampone Facs al pellet cellulare del controllo non macchiato e vortice delicatamente. Quando si lavora con gli splenociti, lavare i campioni dopo la colorazione degli anticorpi direttamente con uno o due millilitri di tampone Facs e centrifugare per cinque minuti. Quindi, scartare il supernatante e drenare il liquido rimanente sugli asciugamani di carta.
Aggiungere 500 microlitri di tampone ACK a ciascun campione di sangue e vortice delicatamente. Quindi, incubare i campioni al buio per cinque minuti a temperatura ambiente. Aggiungere un millilitro di tampone Facs ai campioni e centrifugare.
Quindi, scartare il supernatante e drenare il liquido rimanente con tovaglioli di carta. Una correttalisi degli eriociti è un passo cruciale per facilitare la misurazione dei Facs, quindi, quando il pellet è piuttosto umido, ripetere la llisi degli erociti. Lavare nuovamente i campioni come descritto in precedenza.
Quindi, scartare il supernatante e drenare il liquido rimanente su un tovagliolo di carta. Prima della fissazione, assicurarsi che le cellule siano ben risospese per prevenire la formazione di grumi. Aggiungere da 150 a 300 microlitri di tampone di fissaggio Facs a ciascun tubo e vortice da mescolare.
Quindi, procedere con la misurazione citometrica del flusso il più rapidamente possibile. In primo luogo, misurare i controlli di compensazione e correggere eventuali sovrapposizioni spettrali. Successivamente, impostare i gate sequenziali da selezionare per le celle CD3 positive e CD8-positive.
Cancello sui linfociti usando l'area di dispersione avanti e laterale. Quindi, all'interno della popolazione di linfociti, gate su singole cellule usando la larghezza di dispersione in avanti rispetto all'area. Utilizzare i canali CD3 e CD8 per tracciare i linfociti monocella.
Identificare le cellule T positive cd8, gating su cellule CD3-positive e CD8-positive. Assicurarsi che le celle cd8-low siano incluse nella gating. La propagazione su celle CD3/CD8-positive è un passaggio fondamentale di questo protocollo.
Poiché l'attivazione delle cellule porta spesso a una regolazione verso il basso di CD3 e/o CD8, dovrebbero essere incluse anche le celle a basso contenuto di CD3/CD8. Dopo questo, tracciare le cellule CD8-positive rispetto alle cellule tetramero, gating sulle cellule CD8-positive/tetramer-positive. Se possibile, registrare 20.000 celle nel gate CD3-positivo e CD8-positivo per ogni campione.
Infine, salvare le misure come file FCS. In questo protocollo, le cellule CD8+T specifiche dell'antigene sono state rilevate quantitativamente in campioni di sangue e tessuti. Dopo aver ghiandolato le cellule CD3-positive e CD8-positive, sono state identificate cellule tetramero-positive.
Due tetrameri diversi sono stati combinati nello stesso tubo per la colorazione, consentendo la quantificazione simultanea di due diverse specificità CTL. Utilizzando questo protocollo, le risposte delle cellule T dello stesso mouse possono essere seguite nel tempo, poiché sono necessarie solo piccole quantità di sangue per ogni misurazione. Inoltre, è possibile analizzare fenotipi di CCL specifici dell'antigene.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante evitare tempi di incubazione prolungati, in quanto ciò può portare all'internalizzazione dei recettori delle cellule T. Dalla scoperta della tecnologia tetramero, la colorazione dei tetrameri è diventata uno strumento essenziale per l'analisi delle cellule T e un'ampia gamma di applicazioni, che includono tetrameri che maturano. Un futuro luminoso per tetrameri luminosi.
