Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da imunologia de células T e desenvolvimento de vacinas de vetor viral. A principal vantagem deste método é que apenas pequenas quantidades de sangue são necessárias, o que permite medições repetidas do mesmo rato. Além disso, as CTLs específicas do vírus e transgene podem ser detectadas a partir da mesma amostra.
Demonstrando o procedimento estarão Jasmine Rinnofner, uma técnica, e Annika Rossler, uma estudante de pós-graduação. Medindo e analisando as amostras será Zoltan Banki, um pós-doutor. Para começar, contenha com segurança um mouse de acordo com o protocolo de texto.
Colete 20 microliters de sangue em um tubo revestido de EDTA da veia traseira de um rato. Ao trabalhar com esplenócitos, isole o baço e use o êmbolo de uma seringa para pressionar o tecido através de um coador celular. Após a realização da lise nos eritrócitos, conte as células e ajuste a concentração da amostra.
Prepare e rotule um tubo Facs para cada amostra, e transfira 100 microliters de suspensão de órgãos, ou 20 microliters de sangue para o tubo. Ao trabalhar com esplenócitos, centrifufique a suspensão do órgão por cinco minutos, e descarte o supernatante. Em seguida, vórtice do tubo para resuspensar a pelota celular.
Para cada canal a ser utilizado, também prepare um tubo Facs para uma amostra de compensação. Prepare uma amostra adicional como um controle não manchado. Prepare um tubo com tampões Facs com tetramers em suas diluições ideais e vórtice para misturar.
Em seguida, adicione 50 microliters da diluição do tetramer a cada amostra, e vórtice para misturar. Adicione o buffer Facs sem tetramers aos controles de compensação e à amostra não manchada. Em seguida, incubar as amostras em condições escuras a 37 graus Celsius por 20 minutos.
Enquanto as amostras incubam, adicione o tampão Facs a um tubo. Em seguida, adicione os anticorpos ao buffer de acordo com as diluições especificadas na Tabela 2 do protocolo de texto e o vórtice da solução. Pendentes na questão científica estão as combinações de marcadores, além das descritas aqui, podem ser usadas.
Certifique-se de incluir sempre anticorpos contra CD3 e CD8 no painel. Para cada canal, prepare um tubo com 200 microliters de tampão Facs, e adicione um microliters de uma diluição de anticorpos contra CD8 em sua respectiva cor, e vórtice para misturar. Em seguida, armazene as diluições de anticorpos conforme especificado no protocolo de texto.
Para lavar as amostras, adicione um mililiter de tampão Facs às amostras e centrífuga. Em seguida, descarte o supernaspe e escorra qualquer líquido restante com toalhas de papel. Ao trabalhar com sangue, tenha cuidado ao drenar o líquido restante.
Antes da lise dos eritrócitos, o sangue não grudará no fundo do tubo. Alternativamente, você pode aspirar o supernaspe. Em seguida, adicione 50 microliters da solução de anticorpos a cada pelota celular, e vórtice suavemente.
Adicione 50 microliters de cada mistura de compensação ao controle de compensação correspondente, e 50 microliters de tampão Facs à pelota celular do controle não manchado, e vórtice suavemente. Ao trabalhar com esplenócitos, lave as amostras após a coloração de anticorpos diretamente com um a dois mililitros de tampão Facs e centrífuga por cinco minutos. Em seguida, descarte o supernaspe e escorra o líquido restante em toalhas de papel.
Adicione 500 microliters de tampão ACK a cada amostra de sangue e vórtice suavemente. Em seguida, incubar as amostras no escuro por cinco minutos em temperatura ambiente. Adicione um mililitro de tampão Facs às amostras e centrífuga.
Em seguida, descarte o supernaspe e escorra qualquer fluido restante com toalhas de papel. A lise adequada dos eritrócitos é um passo crucial para facilitar a medição de Facs, portanto, quando a pelota está bastante úmida, repete a lise dos eritrócitos. Lave as amostras novamente como descrito anteriormente.
Em seguida, descarte o supernaspe e escorra qualquer fluido restante em uma toalha de papel. Antes da fixação, certifique-se de que as células estão bem resuspendidas para evitar a formação de aglomerados. Adicione 150 a 300 microliters de Facs fixando tampão em cada tubo, e vórtice para misturar.
Em seguida, prossiga com a medição citométrica de fluxo o mais rápido possível. Primeiro, meça os controles de compensação e corrija para quaisquer sobreposições espectrais. Posteriormente, configure portões sequenciais para selecionar para células CD3 positivos e CD8.
Portão nos linfócitos usando área de dispersão para a frente e para o lado. Em seguida, dentro da população de linfócitos, portão em células únicas usando largura de dispersão para a frente versus área. Use canais CD3 e CD8 para traçar linfócitos unicelulares.
Identifique células T CD8 positivas, gating em células CD3 positivos e CD8-positivos. Certifique-se de que as células cd8-low estão incluídas no gating. A propagação em células CD3/CD8-positivas é um passo crítico neste protocolo.
Como a ativação de células muitas vezes leva à regulação de CD3 e/ou CD8, as células CD3/CD8-low também devem ser incluídas. Depois disso, plote as células CD8 positivas versus as células tetramer, gating nas células CD8-positivas/tetramer-positivas. Se possível, grave 20.000 células no portão CD3 positivo e CD8 positivo para cada amostra.
Finalmente, salve as medidas como um arquivo FCS. Neste protocolo, as células CD8+T específicas de antígeno foram detectadas quantitativamente em amostras de sangue e tecido. Após a gating das células CD3-positivas e CD8-positivas, foram identificadas células tetramer-positivas.
Dois tetramers diferentes foram combinados no mesmo tubo para coloração, permitindo quantificação simultânea de duas especificidades diferentes da CTL. Usando este protocolo, as respostas de células T do mesmo rato podem ser seguidas ao longo do tempo, pois apenas pequenas quantidades de sangue são necessárias para cada medição. Além disso, fenótipos de CTLs específicas de antígeno podem ser analisados.
Ao tentar esse procedimento, é importante evitar tempos prolongados de incubação, pois isso pode levar à internalização dos receptores de células T. Desde a descoberta da tecnologia tetramer, a coloração de tetramer tornou-se uma ferramenta essencial para a análise de células T, e uma ampla gama de aplicações, que incluem o acúmulo de tetramers. Um futuro brilhante para tetramers brilhantes.
