Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der T-Zell-Immunologie und der Entwicklung von viralen Vektorimpfstoffen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass nur geringe Mengen blut benötigt werden, was wiederholte Messungen von der gleichen Maus ermöglicht. Darüber hinaus können virus- und transgenspezifische CTLs aus derselben Probe nachgewiesen werden.
Das Verfahren demonstrieren Jasmine Rinnofner, eine Technikerin, und Annika Rossler, eine Studentin. Die Proben werden gemessen und analysiert, wird Zoltan Banki, ein Post-Doc sein. Um zu beginnen, halten Sie eine Maus sicher gemäß dem Textprotokoll.
Sammeln Sie 20 Mikroliter Blut in einem EDTA-beschichteten Rohr aus der Schwanzvene einer Maus. Bei der Arbeit mit Splenozyten, isolieren Sie die Milz und verwenden Sie den Kolben einer Spritze, um das Gewebe durch ein Zellsieb zu drücken. Nach der Lyse an den Erythrozyten, zählen Sie die Zellen und passen Sie die Konzentration der Probe.
Bereiten und beschriften Sie eine Facs-Röhre für jede Probe und übertragen Sie 100 Mikroliter Organsuspension oder 20 Mikroliter Blut in die Röhre. Bei der Arbeit mit Splenozyten zentrifugieren Sie die Organsuspension für fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Dann wirbeln Sie das Rohr aus, um das Zellpellet wieder aufzuhängen.
Für jeden zu verwendenden Kanal bereiten Sie auch ein Facs-Rohr für eine Kompensationsprobe vor. Bereiten Sie eine zusätzliche Probe als unbefleckte Steuerung vor. Bereiten Sie eine Röhre mit Facs-Puffern mit Tetramern an ihren optimalen Verdünnungen vor, und Wirbel zum Mischen.
Als nächstes fügen Sie 50 Mikroliter der Tetramerverdünnung zu jeder Probe hinzu und wirbeln Sie sie mischen. Fügen Sie den Facs-Puffer ohne Tetramere zu den Kompensationskontrollen und der unbefleckten Probe hinzu. Als nächstes inkubieren Sie die Proben bei dunkelheit bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten.
Während die Proben inkubieren, fügen Sie facs-Puffer zu einem Rohr hinzu. Fügen Sie dann die Antikörper gemäß den in Tabelle 2 des Textprotokolls angegebenen Verdünnungen zum Puffer hinzu, und wirbeln Sie die Lösung aus. Bis zur wissenschaftlichen Frage können die Markerkombinationen, abgesehen von der hier beschriebenen, verwendet werden.
Stellen Sie sicher, dass Sie immer Antikörper gegen CD3 und CD8 in das Panel aufnehmen. Bereiten Sie für jeden Kanal ein Rohr mit 200 Mikroliter Facs Puffer vor und fügen Sie einen Mikroliter einer Antikörperverdünnung gegen CD8 in ihrer jeweiligen Farbe hinzu und wirbeln Sie sie mischen. Speichern Sie dann die Antikörperverdünnungen, wie im Textprotokoll angegeben.
Um die Proben zu waschen, fügen Sie den Proben und der Zentrifuge einen Milliliter Facs-Puffer hinzu. Entsorgen Sie dann den Überstand und entleeren Sie die restliche Flüssigkeit mit Papiertüchern. Seien Sie bei der Arbeit mit Blut vorsichtig, wenn Sie die verbleibende Flüssigkeit abtropfen lassen.
Vor der Lyse der Erythrozyten klebt das Blut nicht an der Unterseite der Röhre. Alternativ können Sie den Überstand ansaugen. Als nächstes fügen Sie 50 Mikroliter der Antikörperlösung zu jedem Zellpellet hinzu und wirbeln Sie sanft.
Fügen Sie 50 Mikroliter jeder Kompensationsmischung zur entsprechenden Kompensationskontrolle hinzu, und 50 Mikroliter Facs puffern dem Zellpellet der unbefleckten Steuerung und wirbeln sanft. Bei der Arbeit mit Splenozyten die Proben nach der Antikörperfärbung direkt mit einem bis zwei Milliliter Facs Puffer und Zentrifuge für fünf Minuten waschen. Entsorgen Sie dann den Überstand und entleeren Sie die restliche Flüssigkeit auf Papiertüchern.
Fügen Sie 500 Mikroliter ACK-Puffer zu jeder Blutprobe hinzu und wirbeln Sie sanft. Dann inkubieren Sie die Proben im Dunkeln für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie den Proben einen Milliliter Facs-Puffer und zentrifugieren hinzu.
Entsorgen Sie dann den Überstand und entleeren Sie die verbleibende Flüssigkeit mit Papiertüchern. Die richtige Lyse von Erythrozyten ist ein entscheidender Schritt, um die Facs-Messung zu erleichtern, daher, wenn das Pellet eher nass ist, wiederholte Lyse von Erythrozyten. Waschen Sie die Proben wie zuvor beschrieben erneut.
Entsorgen Sie dann den Überstand und entleeren Sie die verbleibende Flüssigkeit auf einem Papiertuch. Stellen Sie vor der Fixierung sicher, dass die Zellen gut resuspendiert sind, um die Bildung von Klumpen zu verhindern. Fügen Sie 150 bis 300 Mikroliter Facs Befestigungspuffer zu jedem Rohr hinzu und Wirbel zum Mischen.
Fahren Sie dann so schnell wie möglich mit der zytometrischen Durchflussmessung fort. Erstens messen Sie die Kompensationskontrollen und korrigieren Sie alle spektralen Überlappungen. Anschließend richten Sie sequenzielle Gates ein, um CD3-positive und CD8-positive Zellen auszuwählen.
Tor auf den Lymphozyten mit vorwärts und seitlichen Streubereich. Dann, innerhalb der Lymphozytenpopulation, Tor auf einzelnen Zellen mit Vorwärtsstreubreite versus Fläche. Verwenden Sie CD3- und CD8-Kanäle, um einzellige Lymphozyten zu zeichnen.
Identifizieren Sie CD8-positive T-Zellen, indem Sie auf CD3-positive und CD8-positive Zellen gezwickt werden. Stellen Sie sicher, dass CD8-niedrige Zellen in der Gating enthalten sind. Die Weitergabe auf CD3/CD8-positive Zellen ist ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll.
Da die Aktivierung von Zellen oft zu einer Down-Regulierung von CD3 und/oder CD8 führt, sollten auch CD3/CD8-niedrige Zellen enthalten sein. Danach zeichnen Sie die CD8-positiven Zellen im Vergleich zu den Tetramerzellen auf, indem Sie auf die CD8-positiven/Tetramer-positiven Zellen gezerstäuben. Zeichnen Sie nach Möglichkeit 20.000 Zellen im CD3-positiven und CD8-positiven Gate für jedes Sample auf.
Speichern Sie schließlich die Messungen als FCS-Datei. In diesem Protokoll wurden antigenspezifische CD8+T-Zellen quantitativ in Blut- und Gewebeproben nachgewiesen. Nach dem Gating der CD3-positiven und CD8-positiven Zellen wurden Tetramer-positive Zellen identifiziert.
Zwei verschiedene Tetramere wurden in einem Rohr für die Färbung kombiniert, was eine gleichzeitige Quantifizierung von zwei verschiedenen CTL-Spezifitäten ermöglicht. Mit diesem Protokoll können T-Zell-Antworten von der gleichen Maus im Laufe der Zeit verfolgt werden, da für jede Messung nur geringe Mengen Blut benötigt werden. Zusätzlich können Phänotypen antigenspezifischer CTLs analysiert werden.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, längere Inkubationszeiten zu vermeiden, da dies zu einer Internalisierung von T-Zell-Rezeptoren führen kann. Seit der Entdeckung der Tetramertechnologie ist die Tetramerfärbung zu einem wesentlichen Werkzeug für die T-Zell-Analyse geworden und verfügt über ein breites Anwendungsspektrum, zu denen auch Tetramergehören gehören. Eine glänzende Zukunft für helle Tetramere.
