本视频将演示一个简单的方法，用于同时研究 AML 中的多个候选基因，使用 Crisper-Cas9 系统结合基于流式细胞学的竞争生长测定。这种技术的主要优点是它快速和可扩展。演示这个程序的将是博瑞陈，一个后医生从我们实验室。
基于 Web 的 CRISPR 设计软件用于为感兴趣的基因设计四到六个单导 RNA。首先，在字段中用星号填写相应的信息。然后选择目标基因组进行单导RNA设计。
将目标序列粘贴到序列框中，然后单击提交按钮。对于所需单导RNA表达质粒中的克隆，将核苷酸CACC预至感性蛋白核苷酸和AAAC，以反向互补的寡感寡核苷酸。预混合感和反义寡核苷酸然后从一家公司订购在96井板，标签的奥利戈混合。
设置一个单独的 U-底部 96 井板，标记退体板。准备一个T4多核苷酸激酶的微升，一个10xT4 DNA结扎缓冲液的微升，以及每一个退火反应6微升水的主混合。在退火板的每个井中加入8个主混合物的微升，然后是2个预混合感和反义寡核苷酸的微升。
移液两到三次轻轻地混合好，然后短暂旋转板，使混合到井底。在 PCR 机器中使用以下退火程序。37摄氏度，30分钟，95摄氏度，2分30秒，然后以0.1摄氏度/秒的速度缓慢冷却至22摄氏度。
退火完成后，准备一个新的96井板，标记为稀释的Oligo混合，通过稀释磷酸和退火的寡核苷酸从退火反应1至200用水。利用BBS1限制酶的1.5微升，在37摄氏度下使用适当的缓冲液，在37摄氏度下使用适当的缓冲液，在2小时内消化5微克的载体，使单导RNA表达载体线性化。接下来，采取一个新的96井板标记结扎板，并添加20纳米的BBS1消化单导RNA表达载体到一个井每个所需的单导RNA结扎。
为此，从稀释的寡糖混合板中加入2微升磷酸化退火寡核苷酸。添加到每个井中，一个微升的10X T4连体缓冲液，一个微升的T4连体酶，轻轻移液器混合。在室温下孵育板两小时。
在结扎反应完成前约10分钟，在冰上填充90微升化学能力大肠杆菌细胞。将主管细胞的10微升等分分别转移到单独的96井板的每个井中。将结扎混合物加入含有称职细胞的井中。
轻轻上下移液，在室温下孵育10分钟。移液5微升的细菌DNA混合从每个转化反应直接到一个6井板的井，含有LB汞与100毫克每毫升安西林。在每个井中加入大约 5 到 8 个玻璃珠，并在圆周运动中摇动 6 孔板 8 到 10 次。
在37摄氏度下孵育板过夜。第二天，从每孔中挑选一到两个单菌落，用无菌的 20 微升移液器尖端，将其条纹到无菌 10 厘米培养皿上的标签点上，用 LB agar 和每毫升安皮林 100 毫克条纹到 LB 板上后，将尖端喷射成 14 毫升圆底管中的三毫升安西林介质，标有相应的细菌克隆编号。然后直接将细菌板送去进行桑格测序。
克隆单导RNA的序列确认后，根据制造商的说明，使用微型试剂盒从相应的14毫升管中纯化DNA。单导RNA扁病毒粒子以96井格式产生，如文本协议中所述。病毒上一级在零下80摄氏度后立即被冻结。
在 AML Cas9 细胞中转导单导RNA的一天前一天，涂上经过处理的 96 井板的平底非组织培养物，用 100 毫升重组的人类纤维素片段，浓度为每毫升 10 微克。用粘附包装板，以避免蒸发损失，并放在长凳上过夜。第二天，从96井板的每个井中去除重组的人类纤维素片段。
在室温下解冻每个引导RNA的病毒上一个。将 50 微升的病毒上一液从每个管添加到转导板的每个涂层井中。用粘附包装板，以避免离心过程中的潜在污染。
在35摄氏度下以1，300倍g旋转板，90分钟。在自旋感染接近尾声时，计算从培养瓶中表达克隆 B3 细胞的高 Cas9。计算后，向下旋转所需数量的细胞，并在新鲜介质中重新发送。
在 90 分钟的自旋感染后，使用调整为 50 微升的多通道移液器，通过倾斜板缓慢地从所有孔中去除上流水。将克隆 B3 细胞培养的 100 微升缓慢地添加到每个井中，从边缘向下滑动。在35摄氏度下以1，300倍g旋转板两分钟，让细胞稳定到底部。
将板转移到37摄氏度的组织培养等级培养箱。第二天，向每个含有单导RNA转导细胞的井中加入100微升的新鲜介质，使最终的介质体积为200微升。将盘子返回孵化器。
转导后72小时，通过流式细胞测量检查每个井中含有BFP阳性细胞的单导RNA的百分比。使用细胞活力染料从分析中标记和排除死细胞。每次事实分析后，继续用新鲜介质将一部分细胞重新镀入新井中，以避免在分析过程中过度生长。
每两到三天，重复事实分析，以检查BFP阳性细胞与BFP负细胞的相对比例。使用事实分析软件分析每个时间点的 BFP 阳性细胞百分比。竞争增殖检测成功的关键是使用适当的门控技术，以确保最终的活细胞数是准确的。
将每个示例的 FCS 文件拖动到软件中。双击任何一个样本文件，绘制向前散射与侧散射的点图，在 x 轴上绘制向前散点，在 y 轴上绘制侧散点。门所有的细胞。
双击封闭单元格，并在 y 轴上绘制可行性污渍，与向前散射高度或区域点图。门的生存能力染色阴性细胞。双击封闭活动单元，并在 y 轴上绘制 BFP，在 x 轴上绘制向前散射。
门的BFP阳性细胞。通过将所选样本拖动到组选项卡下的所有样本，将所有这些门应用于所有示例。单击表编辑器，制作所有示例的分析表。
将 BFP 正计数从一个样本拖动到表中，然后单击表编辑器中的显示按钮以创建所有样本的批处理报告，该表显示 BFP 正单元格的百分比。将表另存为 Excel 文件。该系统用于研究基因的作用，可能发挥作用的增殖或生存的人类和穆林ML细胞系。
以AAVS1安全港位点为目标，使用两个独立的单导RNA对人类 MOM13 Cas9 细胞的增殖没有影响。同样，在小鼠MLL-AF9 Cas9细胞中测试了单导RNA针对多普1l（表观遗传调节器）和眼色素沉着基因罗多普辛（Rhodopsin）的效果。单一指南RNA针对Dot1l，显示竞争扩散的戏剧性和渐进性下降，而单一指南RNA的目标是罗多普辛。
这些结果表明，MLL-AF9表示大规模白血病细胞对Dot1l耗竭的脆弱性，证实了先前公布的结果。假设每个基因有4到6个引导RNA，此方法非常适合用于同时测试至少16到24个基因，并且它也可用于测试任何癌细胞系中的基因依赖性。在更多的基因的情况下，如整个分子通路，需要在反洗钱细胞测试，池CRISPR-Cas9为基础的屏幕将更有用。
