このビデオでは、フローサイトメトリーベースの競合成長アッセイと組み合わせたCrisper-Cas9システムを使用して、AML内の複数の候補遺伝子を並行して調査する簡単な方法を紹介します。この手法の主な利点は、高速でスケーラブルな点です。手順のデモンストレーションは、私たちの研究室のポストドキュメントであるBo Rui Chenです。
ウェブベースのCRISPR設計ソフトウェアは、対象遺伝子用の4〜6つの単一のガイドRNAを設計するために使用されます。まず、フィールドの該当する情報にアスタリスクを入力します。次に、単一ガイドRNA設計用の標的ゲノムを選択します。
シーケンスボックスにターゲットシーケンスを貼り付け、送信ボタンをクリックします。所望の単一ガイドRNA発現プラスミドでクローニングする場合、ヌクレオチドCACCをセンスオリオヌクレオチドおよびAAACに逆に無料のアンチセンスオリゴヌクレオチドに付加する。プレミックスセンスとアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴミックスとラベル付けされた96ウェルプレートで会社から注文されます。
アニーリングプレートとラベル付けされた別のU-Bottom 96ウェルプレートをセットします。T4ポリヌクレオチドキナーゼの1マイクロリットル、10x T4 DNAライゲーションバッファーの1マイクロリットル、および6マイクロリットルの水パーアニーリング反応のマスターミックスを調製する。アニーリングプレートの各ウェルにマスターミックスの8マイクロリットルを加え、続いて2マイクロリットルのプレミックスセンスとアンチセンスオリゴヌクレオチドを加えます。
ピペットを2~3回穏やかに混ぜ合わせ、プレートを短く回転させ、ミックスを井戸の底に入れます。PCRマシンでは、次のアニーリングプログラムを使用してください。30分間摂氏37度、摂氏95度を2分30秒、続いて摂氏0.1度/秒の速度で摂氏22度までゆっくりと冷却します。
アニーリングが完了したら、水で焼鈍反応1から200までリン酸化およびアニールオリゴヌクレオチドを希釈することにより、希釈オリゴミックスとラベル付けされた新鮮な96ウェルプレートを調製する。1.5マイクログラムのBBS1制限酵素でベクターを5マイクログラム消化し、摂氏37度で適切なバッファーを2時間使用して、単一ガイドRNA発現ベクターを線形化します。次に、ライゲーションプレートとラベル付けされた新鮮な96ウェルプレートを取り、BBS1消化単一ガイドRNA発現ベクターの20ナノグラムを所望の単一ガイドRNAライゲーションあたり1つのウェルに加えます。
これに、希釈されたオリゴミックスプレートから2マイクロリットルのリン酸化アニールオリゴヌクレオチドを加える。各ウェルに、10X T4リガーゼバッファーの1マイクロリットル、T4リガーゼ酵素の1マイクロリットルを加え、穏やかにピペットを混合します。プレートを室温で2時間インキュベートします。
ライゲーション反応が行われる約10分前に、氷上に化学的に有能な大腸菌細胞の90マイクロリットルを充填する。有能な細胞の10マイクロリットルのアリコートを、個別の96ウェルプレートの各ウェルに個別に移します。有能な細胞を含むウェルにライゲーション混合物を加える。
ピペットを上下に軽くし、室温で10分間インキュベートします。各変質反応から直接6ウェルプレートのウェルに混合する細菌DNAのピペット5マイクロリットルは、アンピシリンのミリリットル当たり100ミリグラムのLB寒天を含む。各ウェルに約5〜8個のガラスビーズを加え、6ウェルプレートを8~10回円運動で振ります。
一晩で摂氏37度でプレートをインキュベートします。翌日、各井戸から1〜2つの単一のコロニーを選び、無菌20マイクロリットルピペットチップを付け、無菌10センチメートルのシャーレのラベル付きスポットにストリークし、LBプレートにストリークした後、アンピシリン1ミリリットルあたり100ミリグラム、先端を14ミリリットルの底管で3ミリリットルに排出します。、対応する細菌クローン番号でマークされます。細菌プレートは、サンガーシーケンシングのために直接送信されます。
クローン化された単一ガイドRNAの配列確認後、メーカーの指示に従ってミニプレップキットを使用して、対応する14ミリリットルチューブからDNAを精製する。単一ガイドRNAレンチウイルス粒子は、テキストプロトコルに記載されているように、96ウェル形式で生成される。そして、ウイルス上清はすぐにマイナス80°Cで凍結されます。
AML Cas9細胞における単一ガイドRNAの導入の1日前に、平底非組織培養処理96ウェルプレートをコーティングし、1ミリリットル当たり10マイクログラムの濃度で組み換えヒトフィブロネクチン断片を100ミリリットル塗布する。蒸発損失を避けるために、しがみつくラップでプレートを包み、一晩ベンチに置いておきます。翌日、96ウェルプレートの各ウェルから組換えヒトフィブロネクチン断片を除去する。
各単一ガイドRNAのウイルス上清を室温で解凍する。各チューブから、トランスダクションプレートの各被覆ウェルに50マイクロリットルのウイルス上清を加えます。遠心分離時の潜在的な汚染を避けるために、プレートをしがみつくラップで包みます。
1、300回で90分間摂氏35度でプレートを回転させます。スプ感染の終わりに向かって、培養フラスコからB3細胞を発現する高Cas9を数える。カウント後、必要なセル数をスピンダウンし、新鮮な培地で再中断します。
90分のスプ感染後、プレートを傾けてすべてのウェルから上清をゆっくりと除去するために50マイクロリットルに調整したマルチチャンネルピペットを使用してください。クローンB3細胞の培養液を100マイクロリットルずつゆっくりと各ウェルに加え、リムから滑り落ちる。セルが底に落ち着くようにするために、摂氏35度で1、300倍gでプレートを回転させます。
プレートを摂氏37度の組織培養グレードインキュベーターに移します。翌日、1つのガイドRNA導入細胞を含む各ウェルに100マイクロリットルの新鮮な培地を加え、最終的な培地容量が200マイクロリットルになるようにします。プレートをインキュベーターに戻します。
72時間後の伝達は、フローサイトメトリーにより各ウェルにBFP陽性細胞を含む単一ガイドRNAの割合を確認する。細胞生存率染料を使用して、死んだ細胞を解析からマークおよび除外します。アッセイ中の過剰増殖を避けるために、すべての事実分析の後、新鮮な媒体で新しい井戸に細胞の割合を再めっきし続けます。
2~3日ごとに、事実分析を繰り返し、BFP陰性細胞と比較したBFP陽性細胞の相対的割合をチェックする。事実分析ソフトウェアを使用して、各時点のBFP陽性セルの割合を分析します。競合的な増殖アッセイの成功の鍵は、最終的な生細胞数が正確であることを確認するために適切な格言技術を使用することです。
各サンプルのFCSファイルをソフトウェアにドラッグします。いずれかのサンプル ファイルをダブルクリックし、X 軸に前方散布図、y 軸に横散布図を使用して、前方散布図と横散布図をプロットします。すべてのセルをゲートします。
ゲートセルをダブルクリックし、y軸と前方散乱高さまたは面積ドットプロットに生存率染色をプロットします。生存率染色負の細胞をゲートします。ゲート付きのライブ セルをダブルクリックし、X 軸上の Y 軸と前方散布図に BFP をプロットします。
BFP陽性細胞をゲートします。グループ タブの下のすべてのサンプルに選択したサンプルをドラッグして、すべてのゲートをすべてのサンプルに適用します。テーブルエディタをクリックして、すべてのサンプルの分析テーブルを作成します。
BFP 正数を 1 つのサンプルから表にドラッグし、テーブルエディタの表示ボタンをクリックして、BFP 陽性セルの割合を表に表示して、すべてのサンプルのバッチレポートを作成します。テーブルを Excel ファイルとして保存します。このシステムは、ヒトおよびマウスAML細胞株の増殖または生存に役割を果たす可能性のある遺伝子の役割を調べるのに使用された。
2つの別々の単一ガイドRNAを有するAAVS1セーフハーバー軌跡を標的にしてもヒトMOM13 Cas9細胞の増殖に影響を及ぼさなかった対照的に、DNA複製関連遺伝子RPA3が標的化された場合、BFPネガティブな未伝達の対応物と比較してBFP陽性細胞の割合が進行的かつ有意に低下することが観察された。同様に、エピジェネティックレギュレータであるDot1lを標的とする単一ガイドRNAと、眼色素沈着遺伝子であるロドプシンの効果を、マウスMLL-AF9 Cas9細胞で試験した。Dot1lを標的とした単一ガイドRNAは、ロドプシンを標的とする単一ガイドRNAとは対照的に、競争増殖の劇的かつ進歩的な減少を示した。
これらの結果は、大量白血病細胞をDot1l枯渇に発現するMLL-AF9の脆弱性を示し、以前に発表された結果を確認した。遺伝子当たり4〜6個のガイドRNAを仮定すると、この方法は少なくとも16〜24個の遺伝子を並行して検査するのに適しており、また、任意の癌細胞株における遺伝子の依存性をテストするために適用することができる。AML細胞で試験する必要がある分子経路全体など、より多くの遺伝子の場合、プールCRISPR-Cas9ベースのスクリーンがより有用であろう。
