이 비디오는 흐름 세포측정 기반경쟁 성장 분석과 결합된 Crisper-Cas9 시스템을 사용하여 AML에서 여러 후보 유전자를 병렬로 조사하는 간단한 방법을 시연할 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 빠르고 확장 가능한 것입니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 게시물 문서 인 Bo Rui Chen이 될 것입니다.
웹 기반 CRISPR 설계 소프트웨어는 관심 유전자에 대한 4 ~ 6 개의 단일 가이드 RNA를 설계하는 데 사용됩니다. 먼저 별표로 필드에 적절한 정보를 입력합니다. 그런 다음 단일 가이드 RNA 설계를 위한 표적 게놈을 선택한다.
시퀀스 상자에 대상 시퀀스를 붙여 넣은 다음 제출 버튼을 클릭합니다. 원하는 단일 가이드 RNA 발현 플라스미드에서 복제를 위해, 뉴클레오티드 CACC를 오리오뉴클레오티드 및 AAAC감각으로 미리 마무리하여 역무료 안티센스 올리고뉴클레오티드에 한다. Pre혼합 감각과 안티센스 올리고뉴클레오티드는 96 웰 플레이트의 회사에서 주문, 표시 올리고 믹스.
별도의 U-Bottom 96 웰 플레이트를 설정, 라벨 안닐링 플레이트. T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 1개, 10x T4 DNA 결찰 완충제 1편, 아닐링 반응당 6마이크로리터의 마스터 믹스를 준비한다. 마스터 믹스 8마이크로리터를 아닐링 플레이트의 각 웰에 넣고, 그 다음에는 미리 혼합된 감각과 안티센스 올리고뉴클레오티드의 마이크로리터 2개를 넣습니다.
파이펫은 부드럽게 잘 혼합한 다음 플레이트를 짧게 회전하여 우물 바닥에 믹스를 가져옵니다. PCR 컴퓨터에서 다음 어닐링 프로그램을 사용합니다. 섭씨 37도, 섭씨 95도 2분 30초, 섭씨 0.1도의 속도로 섭씨 22도까지 천천히 냉각됩니다.
아닐링이 완료되면, 신선한 96 웰 플레이트를 준비, 희석 된 올리고 믹스를 표시, 물과 함께 1 에 200 에 어닐 링 반응에서 인광 및 안절 올리고 뉴클레오티드를 희석하여. BBS1 제한 효소의 1.5 마이크로리터로 벡터의 5마이크로그램을 소화하여 2시간 동안 섭씨 37도에서 적절한 버퍼를 사용하여 단일 가이드 RNA 발현 벡터를 선형화한다. 다음으로, 신선한 96 개의 잘 플레이트 라벨 인 리그레이션 플레이트를 취하고, BBS1 소화 된 단일 가이드 RNA 발현 벡터의 20 나노그램을 원하는 단일 가이드 RNA 결찰당 1개에 첨가한다.
이를 위해 희석된 올리고 믹스 플레이트에서 인광이 함유된 올리고뉴클레오티드 2마이크로리터를 첨가한다. 각 우물에 10X T4 리구효소 완충제 1마이크로리터와 T4 리구효소 의 마이크로리터 1개, 부드럽게 파이펫을 섞어 주세요. 2 시간 동안 실온에서 접시를 배양.
결찰 반응이 완료되기 약 10 분 전에, 얼음에 화학적으로 유능한 대장균 세포의 90 마이크로 리터를 채웁니다. 유능한 세포의 10 마이크로리터 알리쿼트를 각각 의 각 웰로 개별적으로 96개의 웰 플레이트로 전달한다. 유능한 세포를 포함하는 우물에 결찰 혼합물을 추가합니다.
파이펫을 부드럽게 위아래로 하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 각 변형 반응에서 직접 혼합된 박테리아 DNA의 파이펫 5 마이크로리터는 암피실린 밀리리터당 100밀리그램의 LB 한고를 함유하고 있는 6웰 플레이트의 우물로 직접 혼합합니다. 각 우물에 약 5~8개의 유리 구슬을 넣고 6개의 웰 플레이트를 8~10회 흔들어 원형 동작으로 흔들어 줍니다.
하룻밤 사이에 37도에서 접시를 배양하십시오. 다음 날, 멸균 20 마이크로리터 파이펫 팁으로 각 우물에서 1~2개의 콜로니를 골라내고, LB 한천과 암피실린 밀리리터당 100밀리그램을 1밀리리터로 줄인 멸균 10센티미터 페트리 접시에 라벨이 붙은 자리에 줄지어 서서, LB 플레이트에 적신 후 1밀리리터의 100밀리리터를 1밀리리터로 밀어 넣은 후, 1밀리리터의 1밀리리터로 티플을 1밀리리터로 배출하여 1밀리리터의 암페어로 티플을 배출했습니다. , 해당 세균 클론 번호로 표시. 세균성 플레이트는 Sanger 시퀀싱을 위해 직접 전송됩니다.
복제된 단일 가이드 RNA의 순서 확인 후 제조업체의 지침에 따라 미니프렙 키트를 사용하여 해당 14 밀리리터 튜브에서 DNA를 정화합니다. 단일 가이드 RNA 렌즈바이러스 입자는 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 96개의 잘 포맷으로 생성된다. 그리고 바이러스 성 상체는 즉시 영하 80도에서 동결됩니다.
AML Cas9 세포에서 단일 가이드 RNA의 변환 하루 전에, 플랫 바닥 비 조직 배양 처리 96 잘 플레이트, 와 함께 100 밀리리터의 재조합 인간 fibronectin 조각의 농도10 밀리리터 밀리리터 10 밀리리터 당 밀리리터 10 밀리리터. 증발 손실을 피하기 위해 집착 랩으로 접시를 감싸고 밤새 벤치에 둡니다. 다음 날, 96웰 플레이트의 각 웰에서 재조합 인간 섬유네틴 조각을 제거한다.
실온에서 각 단일 가이드 RNA의 바이러스 성 상체를 해동하십시오. 각 튜브에서 50 마이크로리터의 바이러스 성 상피를 각 튜브에 추가합니다. 원심 분리 시 잠재적인 오염을 피하기 위해 접시를 집착 랩으로 감쌉니다.
90분 동안 섭씨 35도에서 1, 300g에서 접시를 회전시다. 소독의 끝으로, 배양 플라스크에서 클론 B3 세포를 발현하는 높은 Cas9를 계산합니다. 계산 후 필요한 셀 수를 스핀다운하고 신선한 배지에서 다시 중단합니다.
90분 후, 50마이크로리터로 조정된 멀티채널 파이펫을 사용하여 판을 기울여 서서히 모든 우물에서 초판을 제거합니다. 클론 B3 세포의 배양 100 마이크로리터를 각각 천천히 천천히 넣고 림에서 아래로 미끄러집니다. 플레이트를 섭씨 35도에서 1, 300회 g에서 2분간 회전하여 세포가 바닥에 정착하도록 합니다.
플레이트를 섭씨 37도 조직 배양 등급 인큐베이터로 옮기. 다음 날에는, 최종 배지 부피가 200 마이크로리터인 단일 가이드 RNA 트랜스듀싱 세포를 포함하는 각 웰에 신선한 배지 100 마이크로리터를 첨가한다. 접시를 인큐베이터에 반환합니다.
72 시간 후 트랜스포메이션, 유동 세포측정에 의해 각 웰에 BFP 양성 세포를 포함하는 단일 가이드 RNA의 백분율을 확인한다. 세포 생존성 염료를 사용하여 분석에서 죽은 세포를 표시하고 제외합니다. 분석 중에 과성장을 피하기 위해 모든 사실 분석 후 새로운 배지로 세포의 비율을 새로운 우물로 다시 도금하십시오.
매 2 ~ 3 일마다, BFP 양수 세포의 상대적 비율을 확인하기 위해 사실 분석을 반복BFP 부정적인 대응에 비해. 팩트 분석 소프트웨어를 사용하여 각 시간 지점에 대한 BFP 양수 셀의 백분율을 분석합니다. 경쟁 확산 분석의 성공의 핵심은 최종 라이브 셀 번호가 정확한지 확인하기 위해 적절한 게이팅 기술을 사용하는 것입니다.
각 샘플의 FCS 파일을 소프트웨어로 드래그합니다. 한 샘플 파일을 두 번 클릭하고 x 축에 전방 분산을 사용하여 측면 분산대 전방 분산점의 점 플롯을 플롯하고 y축에 측면 분산을 제공합니다. 모든 셀을 게이트합니다.
게이트된 셀을 두 번 클릭하고 y축의 생존 가능성 얼룩과 전방 분산 높이 또는 영역 점 플롯을 플롯합니다. 생존성 얼룩 음성 셀을 게이트. 게이트된 라이브 셀을 두 번 클릭하고 y축에 BFP를 플롯하고 x축에 분산된 방향에 대해 b-축을 그립니다.
BFP 양성 셀게이트. 선택한 샘플을 그룹 탭 아래의 모든 샘플로 드래그하여 모든 샘플에 이러한 모든 게이트를 적용합니다. 테이블 편집기를 클릭하여 모든 샘플의 분석 테이블을 만듭니다.
한 샘플에서 테이블로 BFP 양수 수를 드래그하고 테이블 편집기의 표시 버튼을 클릭하여 모든 샘플의 일괄 처리 보고서를 작성하며 표는 BFP 양수 셀의 백분율을 표시합니다. 테이블을 엑셀 파일로 저장합니다. 이 시스템은 인간과 뮤린 AML 세포선의 증식 또는 생존에 있는 역할을 할 수 있는 유전자의 역할을 조사하기 위하여 이용되었습니다.
두 개의 별도 단일 가이드 RNA를 가진 AAVS1 안전 항만 궤적을 표적으로 하는 것은 인간 MOM13 Cas9 세포의 증식에 아무런 영향을 미치지 않았으며, 대조적으로 DNA 복제 관련 유전자인 RPA3가 표적화되었을 때, BFP 음성 비유도 대응에 비해 BFP 양성 세포의 비율에 점진적이고 유의한 감소를 관찰하였다. 유사하게, 후성유전학 레귤레이터인 Dot1l을 표적으로 하는 단일 가이드 RNA의 효과 및 눈 색소 침착 유전자인 로도신은 마우스 MLL-AF9 Cas9 세포에서 시험되었다. Dot1l을 대상으로 한 단일 가이드 RNA는 Rhodopsin을 대상으로 하는 단일 가이드 RNA와 달리 경쟁 확산이 극적이고 점진적인 감소를 보였습니다.
이러한 결과는 MLL-AF9가 도트1l 고갈에 대량 백혈병 세포를 발현하는 취약점을 보여 주며 이전에 발표된 결과를 확인합니다. 유전자 당 4 6 개의 가이드 RNA를 가정, 이 방법은 병렬로 적어도 16 24 유전자를 테스트하는 데 적합하며, 또한 어떤 암 세포주에서 유전자 종속성을 테스트하기 위해 적용 될 수있다. AML 세포에서 시험될 필요가 있는 전체 분자 통로와 같은 유전자의 더 많은 수의 경우에, 풀 CRISPR-Cas9 기지를 둔 스크린은 더 유용할 것입니다.
