Este vídeo demonstrará um método simples para investigar múltiplos genes candidatos em LMA em paralelo, usando o sistema Crisper-Cas9 combinado com o ensaio de crescimento competitivo baseado em citometria de fluxo. A principal vantagem dessa técnica é que ela é rápida e escalável. Demonstrando o procedimento será Bo Rui Chen, um pós-doutor do nosso laboratório.
Um software de design CRISPR baseado na Web é usado para projetar RNAs de quatro a seis guias únicos para o gene de interesse. Para começar, preencha as informações apropriadas nos campos com asteriscos. Em seguida, selecione o genoma alvo para o design de RNA de guia único.
Cole a sequência de destino na caixa de sequência e clique no botão enviar. Para clonagem no guia único desejado plasmídeo de expressão RNA, prepend os nucleotídeos CACC para o sentido oglionucleotídeo e AAAC para o oligonucleotídeo antissamparado reverso. O sentido pré-misturado e oligonucleotídeos antissamo-americanos são então encomendados de uma empresa em uma placa de 96 poços, rotulada Oligo Mix.
Coloque uma placa de poço U-Bottom 96 separada, rotulada placa de annealing. Prepare uma mistura mestre de um microliter de T4 polinucleotídeo quinase, um microliter de 10x T4 tampão de ligadura de DNA, e seis microliters de água por reação de ressarcimento. Adicione 8 microliters da mistura mestre a cada poço da Placa de Enraizamento, seguido por 2 microliters de sentido pré-x e oligonucleotídeos antissamonucleotídeos.
Pipeta duas a três vezes suavemente para misturar bem, e, em seguida, gire a placa brevemente para obter as misturas para o fundo dos poços. Use o seguinte programa de ressarção em uma máquina PCR. 37 graus Celsius durante 30 minutos, 95 graus Celsius por dois minutos e 30 segundos, seguido de resfriamento lento a 22 graus Celsius a uma taxa de 0,1 graus Celsius por segundo.
Quando o ressarcimento estiver completo, prepare uma placa fresca de 96 poços, rotulada de Mistura Oligo Diluída, diluindo os oligonucleotídeos fosforilados e enlatados da reação de ressarcimento de um a 200 com água. Linearize o vetor de expressão RNA de guia único digerindo cinco microgramas do vetor com 1,5 microliters de enzima de restrição BBS1, usando um buffer apropriado a 37 graus Celsius por duas horas. Em seguida, pegue uma placa de ligation fresca de 96 bem rotulada, e adicione 20 nanogramas do vetor de expressão RNA de guia único do BBS1 a um bem por ligadura de guia único desejada.
Para isso, adicione 2 microliters de oligonucleotídeos relados fosfoilados da placa Oligo Mix diluída. Adicione a cada poço, um microliter de tampão de ligase 10X T4, e um microliter de enzima ligase T4, e pipeta suavemente para misturar. Incubar a placa em temperatura ambiente por duas horas.
Cerca de 10 minutos antes da reação de ligadura ser feita, encha 90 microliters de células E.coli quimicamente competentes no gelo. Transfira 10 alíquotas de microliter das células competentes para cada poço de uma placa de 96 bem separada individualmente. Adicione a mistura de ligadura nos poços que contêm as células competentes.
Pipeta para cima e para baixo suavemente, e incubar em temperatura ambiente por 10 minutos. Pipeta cinco microliters da bactéria DNA misturam-se de cada reação de transformação diretamente em um poço de uma placa de 6 poços, contendo ágar LB com 100 miligramas por mililitro de ampicillina. Adicione aproximadamente cinco a oito contas de vidro a cada poço, e agite a placa de 6 poços oito a dez vezes em um movimento circular.
Incubar as placas a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, escolha uma a duas colônias únicas de cada poço, com uma ponta de pipeta de 20 microliteres estéril, e coloque-a em um ponto rotulado em uma placa de petri de 10 centímetros estéril, com ágar LB e 100 miligramas por mililitro de ampicillina Depois de estiliar na placa LB, ejete a ponta em três mililitros de ampicillina média em um tubo de 14 mililitros em um tubo de fundo redondo de 14 mililitros. , marcado com o número correspondente do clone bacteriano. A placa bacteriana é então enviada diretamente para sequenciamento Sanger.
Após uma confirmação sequencial do guia único clonado RNAs, purifique o DNA do tubo correspondente de 14 mililitros, usando um kit miniprep de acordo com as instruções do fabricante. As partículas lentiviras de RNA guia única são produzidas em um formato de poço 96, conforme descrito no protocolo de texto. E o supernante viral é imediatamente congelado a menos 80 graus Celsius.
Um dia antes da transdução de RNAs guia único em células AML Cas9, cubra uma cultura plana de fundo não tecido tratada 96 placas de poço, com 100 mililitros de fragmento de fibronectina humana recombinante a uma concentração de 10 microgramas por mililitro. Enrole a placa com envoltório de aderência para evitar a perda de evaporação e deixe-a no banco durante a noite. No dia seguinte, remova o fragmento de fibronectina humana recombinante de cada poço da placa do poço 96.
Descongele o supernatante viral de cada RNA guia a temperatura ambiente. Adicione 50 microliters de supernascer viral de cada tubo a cada poço revestido da placa de transdução. Enrole a placa com envoltório de aderência para evitar contaminação potencial durante a centrifugação.
Gire a placa a 1.300 vezes g a 35 graus Celsius por 90 minutos. No final da spinfecção, conte o alto Cas9 expressando células B3 do frasco de cultura. Após a contagem, abaixe o número necessário de células e resuspense em meio fresco.
Após a 90 minutos de spinfection, use uma pipeta multicanal ajustada a 50 microliters para remover o sobrenante de todos os poços lentamente inclinando a placa. Adicione 100 microliter da cultura das células B3 clones a cada poço lentamente, deslizando para baixo da borda. Gire a placa a 1.300 vezes g a 35 graus Celsius por dois minutos para deixar as células se acomodarem até o fundo.
Transfira a placa para uma incubadora de grau de cultura de tecido de 37 graus Celsius. No dia seguinte, adicione 100 microliters de meio fresco a cada poço contendo células transduzidas por RNA de guia único, de tal forma que o volume médio final seja de 200 microliters. Devolva a placa para a incubadora.
72 horas após a transdução, verifique a porcentagem de RNA guia único contendo células positivas de BFP em cada poço por citometria de fluxo. Use um corante de viabilidade celular para marcar e excluir células mortas da análise. Continue reescarando uma proporção das células em novos poços com meio fresco após cada análise de fatos para evitar o crescimento excessivo durante o ensaio.
A cada dois ou três dias, repita a análise dos fatos para verificar a proporção relativa de células positivas de BFP em comparação com as contrapartes negativas do BFP. Analisar a porcentagem de células positivas de BFP para cada ponto de tempo, utilizando um software de análise de fatos. A chave para o sucesso do ensaio de proliferação competitiva é usar as técnicas adequadas de gating para garantir que os eventuais números de células vivas sejam precisos.
Arraste arquivos FCS para cada amostra no software. Clique duas vezes em qualquer arquivo de amostra e plote um gráfico de ponto de dispersão para a frente versus dispersão lateral, com dispersão para a frente no eixo x e dispersão lateral no eixo y. Portão todas as células.
Clique duas vezes nas células fechadas e local de vibilidade do gráfico no eixo y versus altura de dispersão dianteira ou gráfico de ponto de área. Portão a viabilidade mancha células negativas. Clique duas vezes nas células ao vivo fechadas e plote BFP no eixo y versus dispersão para a frente no eixo x.
Portão das células positivas BFP. Aplique todos esses portões a todas as amostras arrastando a amostra selecionada para todas as amostras sob a guia do grupo. Clique no editor de tabela para fazer uma tabela de análise de todas as amostras.
Arraste a contagem positiva do BFP de uma amostra para a tabela e clique no botão de exibição no editor de tabela para criar um relatório em lote de todas as amostras, com a tabela exibindo a porcentagem de células positivas de BFP. Salve a tabela como um arquivo excel. Este sistema foi usado para investigar o papel dos genes que podem desempenhar um papel na proliferação ou sobrevivência das linhas celulares humanas e murinas da LMA.
O alvo do lócus de porto seguro AAVS1 com dois RNAs guia único separado não teve efeito na proliferação de células humanas MOM13 Cas9 Em contraste, quando o gene associado à replicação de DNA, RPA3, foi direcionado, observou-se um declínio progressivo e significativo no percentual de células positivas de BFP em comparação com as contrapartes negativas não traduzidas do BFP. Da mesma forma, os efeitos das RNAs de guia única visando Dot1l, um regulador epigenético, e Rhodopsin, o gene de pigmentação ocular, foram testados em células MLL-AF9 Cas9 do mouse. O guia único RNAs visando o Dot1l, mostrou um declínio dramático e progressivo na proliferação competitiva em contraste com o guia único RNAs visando Rhodopsin.
Esses resultados demonstram a vulnerabilidade do MLL-AF9 expressando células de leucemia em massa ao esgotamento do Dot1l, confirmando resultados publicados anteriormente. Assumindo quatro a seis RNAs guia por gene, este método é bem adequado para ser usado para testar pelo menos 16 a 24 genes em paralelo, e também pode ser aplicado para testar dependências genéticas em qualquer linha celular cancerosa. No caso de um número maior de genes, como toda uma via molecular que precisa ser testada em células AML, as telas baseadas em pool CRISPR-Cas9 serão mais úteis.
