该方法将DNA纳米技术从线性寡核苷酸DAS的源材料扩展到一些圆形的DAS。这些技术的主要优点是,它对于大多数实验室来说简单、坚固且经济实惠。对于圆形DNA纯化,将20微升的甲酰胺加入新鲜准备好的圆形DNA溶液中,加入140微升的混拌液中。
将 16 至 20 微升的圆形 DNA 溶液加载到 7 到 9 个变性 PAGE 凝胶井中。将两个微升的装料染料与相应的前体线性DNA的八微升混合,将混合物注入单独的参考井中。然后以每厘米 10 伏特的速度运行凝胶约两个小时,当二甲苯氰醇 FF 观察到凝胶下约三分之二时停止运行。
戴上橡胶手套和护目镜,将凝胶转移到荧光薄层色谱板上,并使用剃须刀刀片切断目标凝胶带,就像紫外线照射所蒙上阴影一样。将凝胶带放入两毫升微离心管中干燥,然后将干燥的凝胶捣碎成糊状,以两倍的凝胶体积加入去离子水,在室温下过夜摇动。第二天早上,将混合物过滤成两毫升的微离心管,用少量去离子水冲洗第一管的两侧,以回收任何残留的DNA,然后再次过滤以结合超生。
然后通过乙醇沉淀净化圆形DNA,将DNA储存在零下20摄氏度。对于一盆退火,混合两个微升10倍醋酸三酯EDTA镁缓冲液,每10微摩尔DNA存量溶液中的一微升,一组线性和圆形链的摩尔比例相等,并在200微升PCR试管中加入Tris EDTA缓冲液,最终体积为20微升。然后在 95 至 25 摄氏度的热瓶中摄像,超过 48 小时。将装配溶液退火。
对于无限格子的两步退火,混合两个微升的10倍三酯醋酸化镁缓冲液,每10微摩尔DNA存量溶液中的一微升,一组线性和圆形链的摩尔比例相等,并在200微升PCR试管中加入额外的Tris EDTA缓冲液,最终体积为20微升。在第一个亚瓦退火步骤中,使用从 95 摄氏度到 25 摄氏度的快速线性冷却方法,在两个半小时内,将 PCR 热循环器中每个前体子瓦溶液退火。为了准备装配解决方案,对于四个无限格子中每个格子,将两个相应子片溶液的 10 微升混合在一起,最终浓度为每股 0.25 微摩尔。
在第二个晶格退火步骤中,使用慢速冷却方法将 20 微升混合物退火到 PCR 热循环器中。对于两个有限矩形格子的两步退火,混合一个微升的10倍三叶乙酸酯EDTA镁缓冲液,0.5微升每10微摩尔DNA存量溶液的一组线性和圆形链在相等摩尔比,和额外的Tris EDTA缓冲液在200微升PCR试管,到10微升的最终体积。在第一个退火步骤中,在PCR热循环器中,使用快速线性冷却方法,如证明,在2个半小时内,将退火32个子瓦溶液混合,每个前体子片溶液与2微升混合在200微升PCR试管中,最终体积为64微升。
然后,在第二个退火步骤中,使用慢速冷却方法将热循环器中的 64 微升混合物退火,如所证明的。对于有限晶格的电泳纯化,准备一个本地2%的阿加罗斯凝胶,将20微升的有限晶格溶液加载到每一个井中,并在单独的井中加入5微升100至3000基对DNA梯。在冰水浴中以每百厘米5伏运行凝胶两小时后,在紫外线照射下将目标凝胶带切入约1000个碱基对标记的水平,然后将凝胶带切成细片。
将碎凝胶放入过滤柱中,然后离心柱以提取格子。然后,收集原子力显微镜成像的溶液。对于聚乙烯乙二醇(PEG)的有限晶格纯化,将有限晶格溶液的50微升与15%PEG 8000缓冲液的等量混合,将溶液离心,将颗粒重新悬浮在PEG缓冲液的100微升中,进行额外的离心。
第二次离心后,重新悬浮三酯醋酸EDTA镁缓冲液中的颗粒,用于原子力显微镜成像。对于无限 2D 晶格原子力显微镜成像,切开一层新鲜的云母,将两个微升的退火样品沉积到干净的表面上。让DNA格子吸收到云母表面两分钟,在洗涤表面前两次,每次洗涤用100微升去离子水,第二次洗涤后用压缩空气干燥表面。
要获得空气中无限DNA格子的原子力显微镜图像,打开成像软件中的攻丝模式,将扫描大小设置为0.5至5微米,扫描分辨率为512线,扫描速率在1至3.5赫兹之间。然后,用三角原子力显微镜探头扫描云母表面。对于有限的DNA格子成像,如所证明,切掉一层新鲜的云母,将80微升的一次性三叠醋酸EDTA镁缓冲液沉积到干净的云母表面。
接下来,在缓冲液中加入5个微升的有限样品,让DNA格子吸收到云母表面两分钟,然后再在探针中再加入50微升的三氧化二乙酸酯EDTA镁缓冲液。然后,将扫描大小设置为 0.5 至 1 微米,将扫描分辨率设置为 256 行,将扫描速率设置为 1.5 赫兹,然后使用三角形探头扫描表面,如所演示的。圆形DNA在变性页面中的前体线性DNA移动速度略慢,因为圆形DNA内的孔隙被凝胶纤维穿透和延缓。
圆形64核苷酸组装系列每个装配体只有一个清晰干净的带子,确认了其单体图案的稳定性。然而,圆形84核苷酸组装系列瓷砖,在其主要带周围有污迹,表明存在次要的亚基产品。无论产品是不正确的关联产品,高产量的优秀格子可以从目标单体图案组装。
每个组件在千分尺尺度上都有自己的形态特征,如纳米线、纳米管、纳米螺旋、纳米龙和纳米角。在尝试此过程时,必须记住避免在步骤中或步骤关闭过程中发生碎屑污染。该技术开发后,为DNA纳米技术领域的研究开辟了道路,以探索一些圆形DNA纳米技术的新家族成员。