Diese Methode erweitert die DNA-Nanotechnologie aus den Ausgangsmaterialien des linearen Oligonukleotids DAS in einige kreisförmige DAS. Die Hauptvorteile dieser technischen sind, dass es eine einfache, robuste und erschwinglich für die meisten Labore ist. Zur kreisförmigen DNA-Reinigung 20 Mikroliter Formamid zu einer Lösung frisch zubereiteter, intakter kreisförmiger DNA zu einem Endvolumen von 140 Mikrolitern mit Mischen hinzufügen.
Laden Sie 16 bis 20 Mikroliter kreisförmige DNA-Lösung auf jeweils sieben bis neun denaturierende PAGE-Gelbrunnen. Mischen Sie zwei Mikroliter Ladefarbstoff mit acht Mikrolitern der entsprechenden Vorläufer-Linear-DNA und injizieren Sie das Gemisch in einen separaten Referenzbrunnen. Dann laufen Sie das Gel für etwa zwei Stunden bei 10 Volt pro Zentimeter, stoppen Sie den Lauf, wenn das Xylol Cyanol FF etwa zwei Drittel des Gels beobachtet werden kann.
Tragen Sie Gummihandschuhe und Schutzbrille, übertragen Sie das Gel auf eine fluoreszierende dünnschichtige Chromatographieplatte und schneiden Sie die von der UV-Bestrahlung beschatteten Zielgelbänder mit einer Rasierklinge ab. Die Gelbänder zum Trocknen in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr geben, dann die getrockneten Gele in eine Paste zermahlen und deionisiertes Wasser bei doppeltso viel Gel hinzufügen, zum überNachtschütteln bei Raumtemperatur. Am nächsten Morgen filtern Sie das Gemisch in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr, spülen die Seiten des ersten Rohres mit einem kleinen Volumen an enionisiertem Wasser, um Rest-DNA wiederherzustellen, und filtern Sie wieder, um die Supernate zu kombinieren.
Dann reinigen Sie die kreisförmige DNA über Ethanol-Fällung, und speichern Sie die DNA bei minus 20 Grad Celsius. Mischen Sie für ein Topfglühen zwei Mikroliter 10-fachen TrisAcetat EDTA Magnesiumpuffer, je 10 Mikromol-DNA-Stammlösung aus einem Satz linearer und kreisförmiger Stränge in gleichen Molarenverhältnissen und zusätzlichen Tris EDTA-Puffer in einem 200-Mikroliter-PCR-Testrohr auf ein Endvolumen von 20 Mikrolitern. Dann die Montagelösung in einer Thermoflasche von 95 bis 25 Grad Celsius, über 48 Stunden.
Mischen Sie für das zweistufige Glühen von unendlichen Gittern zwei Mikroliter des 10-fachen Trisacetat EDTA Magnesiumpuffers, einen Mikroliter jeder 10 mikromollaren DNA-Stammlösung eines Satzes linearer und kreisförmiger Stränge in gleichen Molarenverhältnissen und zusätzlichen Tris EDTA-Puffer in einem 200-Mikroliter-PCR-Teströhrchen auf ein Endvolumen von 20 Mikrolitern. Im ersten Unterkachel-Glühschritt wird jede Vorläufer-Unterkachellösung in einem PCR-Thermocycler mit einer schnellen linearen Kühlmethode von 95 bis 25 Grad Celsius über zweieinhalb Stunden annealiert. Zur Vorbereitung der Montagelösung mischen Sie für jedes der vier unendlichen Gitter 10 Mikroliter der beiden entsprechenden Unterfliesenlösungen zu einer Endkonzentration von 0,25 Mikromolaren für jeden Strang.
Im zweiten Gitter-Glühschritt wird die 20-Mikroliter-Mischung in einem PCR-Thermocycler mit einem langsamen Kühlverfahren anneal. Mischen Sie für zweistufiges Glühen von zwei endlichen Rechteckgittern einen Mikroliter 10-fachen Trisacetat EDTA Magnesiumpuffer, 0,5 Mikroliter je 10 mikromolare DNA-Lagerlösung eines Satzes linearer und kreisförmiger Stränge in gleichen Molarenverhältnissen und zusätzlichen Tris EDTA-Puffer in einem 200-Mikroliter-PCR-Teströhrchen zu einem Endvolumen von 10 Mikrolitern. Im ersten Glühschritt wird jede Vorläufer-Unterkachellösung im PCR-Thermocycler mit der schnellen linearen Kühlmethode, wie gezeigt, von 95 bis 25 Grad Celsius über zweieinhalb Stunden annealiert und die geglühten 32 Sub-Fliesen-Lösungen mit jeweils 2 Mikrolitern in einem 200-Mikroliter-PCR-Reagenzglas auf ein Endvolumen von 64 Mikrolitern gemischt.
Dann, im zweiten Glühschritt, die 64-Mikroliter-Mischung im Thermocycler mit dem langsamen Kühlverfahren annealieren, wie gezeigt. Für die Elektrophorese-Reinigung der endlichen Gitter, bereiten Sie ein natives 2%Agarose-Gel vor und laden Sie 20 Mikroliter der endlichen Gitterlösung in jeden Brunnen, zusammen mit der Zugabe von 5 Mikrolitern einer 100 bis 3000 Base-Pair-DNA-Leiter, in einem separaten Brunnen. Nachdem Sie das Gel zwei Stunden lang bei 5 Volt pro Zentimeter in einem Eiswasserbad laufen lassen, schneiden Sie die Zielgelbänder auf etwa dem Niveau des 1000-Basispaar-Markers unter UV-Licht, wie gezeigt, und schneiden Sie die Gelbänder in feine Stücke.
Legen Sie die zerkleinerten Gele in eine Filterspalte und zentrieren Sie die Säule, um die Gitter zu extrahieren. Sammeln Sie dann die Lösung für die Atomkraftmikroskopie-Bildgebung. Zur endlichen Gitterreinigung durch Polyethalinglycol oder PEG 50 Mikroliter der endlichen Gitterlösung mit einem gleichen Volumen von 15%PEG 8000 Puffer mischen, die Lösung zentrifugieren und das Pellet in 100 Mikroliter PEG-Puffer für eine zusätzliche Zentrifugation wieder aufsetzen.
Nach der zweiten Zentrifugation das Pellet im Trisacetat EDTA Magnesiumpuffer für die Atomkraftmikroskopie wieder aufsetzen. Für eine unendliche 2D-Gitter-Atomkraftmikroskop-Bildgebung, spalten Sie eine frische Schicht Glimmer ab und legen Sie zwei Mikroliter der geglühten Probe auf die saubere Oberfläche ab. Lassen Sie die DNA-Gitter zwei Minuten auf die Glimmeroberfläche zu absorbieren, bevor Sie die Oberfläche zweimal waschen, mit 100 Mikroliter enionisiertem Wasser pro Wäsche, die Oberfläche nach der zweiten Wäsche mit Druckluft trocknen.
Um Atomkraftmikroskopbilder der unendlichen DNA-Gitter in der Luft zu erhalten, öffnen Sie den Abstichmodus in der Bildgebungssoftware und stellen Sie die Scangröße auf 0,5 bis fünf Mikrometer, die Scanauflösung auf 512 Zeilen und die Scanrate zwischen einem und 3,5 Hertz ein. Scannen Sie dann die Glimmeroberfläche mit dreieckigen Atomkraftmikroskoponen. Für endliche DNA-Gitter, die bildgebungsbildn sind, spalten Sie eine frische Schicht Glimmer, wie gezeigt, und legen Sie 80 Mikroliter eines Falte Tris Acetat EDTA Magnesiumpuffers auf die saubere Glimmeroberfläche ab.
Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter endlicher Proben in den Puffer ein und lassen Sie die DNA-Gitter zwei Minuten auf die Glimmeroberfläche aufnehmen, bevor Sie der Sonde weitere 50 Mikroliter Tris Acetat EDTA Magnesiumpuffer hinzufügen. Stellen Sie dann die Scangröße auf 0,5 bis ein Mikrometer, die Scanauflösung auf 256 Zeilen und die Scanrate auf 1,5 Hertz ein, bevor Sie die Oberfläche mit den dreieckigen Sonden scannen, wie gezeigt. Die kreisförmige DNA bewegt sich etwas langsamer als ihre lineare Vorläufer-DNA in der denaturierenden PAGE, da die Pore in der kreisförmigen DNA durch die Gelfasern durchdrungen und verzögert wird.
Die kreisförmigen 64 Nukleotid-Montagefamilien haben für jede Baugruppe nur ein klares und sauberes Band, was die Stabilität ihrer Monomermotive bestätigt. Die kreisförmigen 84 Nukleotid-Montagefamilien von Fliesen haben jedoch Abstriche um ihre Hauptbänder, was auf das Vorhandensein kleinerer Nebenprodukte hinweist. Unabhängig von den Nebenprodukten falscher Mitarbeiter lassen sich aus den Zielmonomermotiven hervorragende Gitter mit hohen Erträgen zusammenbauen.
Jede Baugruppe hat ihre eigenen morphologischen Merkmale im Mikrometermaßstab, wie Nanodrähte, Nanoröhren, Nanospiralen, Nanobänder und Nanorechtecke. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, insbesondere eine Verunreinigung von Schmutz während oder außerhalb der Stufen zu vermeiden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forschungen auf dem Gebiet der DNA-Nanotechnologie, um neue Familienmitglieder einer kreisförmigeren DNA-Nanotechnologie zu erforschen.
