Este método estende a nanotecnologia de DNA dos materiais de origem do oligonucleotídeo linear, DAS, em algumas DAS mais circulares. As principais vantagens desses técnicos são que ele é simples, robusto e acessível para a maioria dos laboratórios. Para purificação circular de DNA, adicione 20 microlitrais de formamida a uma solução de DNA circular recém-preparado e intacto, a um volume final de 140 microliters com mistura.
Carregar de 16 a 20 microliters de solução de DNA circular para cada um dos sete a nove poços de gel PAGE desnaturação. Misture dois microliters de corante de carga com oito microliters do DNA linear precursor correspondente, e injete a mistura em um poço de referência separado. Em seguida, execute o gel por cerca de duas horas a 10 volts por centímetro, parando a corrida quando o FF xileno cyanol pode ser observado cerca de dois terços abaixo do gel.
Usando luvas de borracha e óculos, transfira o gel para uma placa de cromatografia fluorescente de camada fina, e use uma lâmina de barbear para cortar as faixas de gel alvo, como sombreado pela irradiação UV. Coloque as bandas de gel em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros para secagem, em seguida, amasse os géis secos em uma pasta, e adicione água desionizada com o dobro do volume de gel, para tremer durante a noite à temperatura ambiente. Na manhã seguinte, filtre a mistura em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros, enxaguando as laterais do primeiro tubo com um pequeno volume de água desionizada para recuperar qualquer DNA residual, e filtrando novamente para combinar os supernatos.
Então purifique o DNA circular através da precipitação de etanol, e armazene o DNA a menos 20 graus Celsius. Para um recozimento de pote, misture dois microliters de 10 vezes o tampão de magnésio EDTA tris de 10 vezes, um microliter de cada 10 soluções de estoque de DNA micromolar de um conjunto de fios lineares e circulares em proporções molares iguais, e tampão Tris EDTA adicional em um tubo de teste PCR de 200 microliteres, para um volume final de 20 microliters. Em seguida, ressupere a solução de montagem em uma garrafa térmica de 95 a 25 graus Celsius, ao longo de 48 horas.
Para a recozimento em duas etapas de retaliças infinitas, misture dois microlitadores de tampão de magnésio EDTA 10 vezes, um microliter de cada 10 soluções de estoque de DNA micromolar de um conjunto de fios lineares e circulares em proporções molares iguais, e tampão Tris EDTA adicional em um tubo de teste PCR de 200 microlitres, para um volume final de 20 microliters. No primeiro passo de ressarcimento de subálteis, anneal cada solução precursora subátil em um termociclador PCR, usando um método de resfriamento linear rápido de 95 a 25 graus Celsius, ao longo de duas horas e meia. Para preparar a solução de montagem, para cada uma das quatro treliças infinitas, misture 10 microliters de cada uma das duas soluções subárparais correspondentes, a uma concentração final de 0,25 micromolar para cada fio.
No segundo passo de retração, ressare a mistura de 20 microliter em um termociclador PCR, utilizando um método de resfriamento lento. Para dois passos de annealing de duas treliças retângulo finita, misturar um microliter de 10 vezes tris acetato EDTA tampão de magnésio, 0,5 microliters de cada 10 micromolar solução de estoque de DNA de um conjunto de fios lineares e circulares em proporções molares iguais, e tampão Tris EDTA adicional em um tubo de teste PCR de 200 microlitres, para um volume final de 10 microliters. Na primeira etapa de ressarcimento, ressurrea cada solução precursora de subátilo no termociclador PCR, utilizando o método de resfriamento linear rápido, como demonstrado, de 95 a 25 graus Celsius, ao longo de duas horas e meia, e misture as 32 soluções subplilhas, cada uma com 2 microliters, juntamente em um tubo de teste PCR de 200 microlitres, a um volume final de 64 microliters.
Em seguida, na segunda etapa de ressarcimento, anneal a mistura de 64 microliter no termociclador, usando o método de resfriamento lento, como demonstrado. Para purificação da eletroforese das treliças finitas, prepare um gel nativo de 2%agarose e carregue 20 microlitres da solução de rede finita em cada poço, juntamente com a adição de 5 microliters de uma escada de DNA de 100 a 3000 pares de base, em um poço separado. Depois de executar o gel por duas horas a 5 volts por centímetro em um banho de água gelada, corte as bandas de gel alvo em cerca de o nível do marcador de par base 1000 sob luz UV, como demonstrado, e corte as bandas de gel em pedaços finos.
Coloque os géis triturados em uma coluna de filtro e centrifufique a coluna para extrair as treliças. Então, colete a solução para imagens de microscopia de força atômica. Para purificação finita de rede por poliethalene glycol, ou PEG, misture 50 microliters da solução de rede finita com um volume igual de 15%PEG 8000 tampão, centrifugar a solução e suspender a pelota em 100 microliters de tampão PEG, para uma centrifugação adicional.
Após a segunda centrifugação, suspenda a pelota no tampão de magnésio EDTA de acetato tris, para imagens de microscopia de força atômica. Para imagens infinitas de microscópio de força atômica de rede 2D, corte uma camada fresca de mica, e deposite dois microlitros da amostra enroscava na superfície limpa. Deixe os treliças de DNA dois minutos para absorver à superfície mica, antes de lavar a superfície duas vezes, com 100 microliters de água desionizada por lavagem, secando a superfície com ar comprimido após a segunda lavagem.
Para obter imagens de microscópio de força atômica das infinitas treliças de DNA no ar, abra o modo de toque no software de imagem e ajuste o tamanho da varredura para 0,5 a cinco micrômetros, a resolução do scan para 512 linhas e a taxa de varredura entre um a 3,5 Hertz. Em seguida, escaneie a superfície mica com sondas de microscópio de força atômica triangular. Para imagens finitas de dna, corte uma camada fresca de mica, como demonstrado, e deposite 80 microliters de uma dobra Tris acetato EDTA tampão de magnésio na superfície mica limpa.
Em seguida, adicione cinco microliters de amostras finitas no buffer, e permita que as treliças de DNA dois minutos absorvam à superfície mica, antes de adicionar outros 50 microliters de tampão de magnésio EDTA tris acetato à sonda. Em seguida, ajuste o tamanho da varredura para 0,5 a um micrômetro, a resolução da varredura para 256 linhas e a taxa de varredura para 1,5 Hertz, antes de digitalizar a superfície com as sondas triangulares, como demonstrado. O DNA circular se move um pouco mais lento do que seu DNA linear precursor na PÁGINA de desnaturação, porque o poro dentro do DNA circular é penetrado e retardado pelas fibras de gel.
As montagem circulares de 64 nucleotídeos têm apenas uma banda limpa e limpa para cada montagem, confirmando a estabilidade de seus motivos monômeros. As 84 famílias de conjuntos nucleotídeos circulares de telhas, no entanto, possuem manchas ao redor de suas principais bandas, indicando a presença de subprodutos menores. Independentemente do menor por produtos de associados incorretos, excelentes retíticos com altos rendimentos podem ser montados a partir dos motivos do monômero alvo.
Cada conjunto tem suas próprias características morfológicas na escala de micrômetros, como nanofios, nanotubos, nanospirais, nano-ibbons e nanorectangles. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de evitar, particularmente, a contaminação de detritos durante ou fora das etapas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisas no campo da nanotecnologia de DNA explorar novos membros da família de alguma nanotecnologia de DNA mais circular.
