蛋白酶是学术和工业研究中研究最多的生物分子支持组之一。它们在多个生理和病理过程中的强大作用也使他们成为药物发现领域的突出目标。在深入的研究方面，对开发省时、节省成本的高通量筛选相容荧光蛋白酶检测平台的需求巨大且持续。
在这里，我们想介绍一个协议，使用mTurquoise2和mApple-熔融融合蛋白酶基板应用基于分离的高通量筛选兼容荧光测定平台。此外，我们还需要演示一种在变性SDS-PAGE后，对基材进行凝胶内再饱和的方法和测定样品的裂解片段。所有实验都是以HIV-1病毒蛋白酶为例进行的。
该表达质粒携带六角沙和麦芽糖结合融合蛋白的编码序列，然后是烟草蚀刻病毒蛋白酶的控制性裂解位点、克隆盒和C-终端荧光蛋白。通过PacI和NheI限制内分导线性化表达式质粒。执行 Escherichia 大肠杆菌的退火优化正向和反向寡核苷酸质剂，编码为基底序列的兴趣和侧翼由 PacI 和 NheI 内聚端。
通过结扎将退火线插入线性化表达质粒。对于蛋白质表达，通过结扎混合物转换BL21（DE3）能力细胞。荧光蛋白只有在成功结扎后，才能与N端子融合标签位于同一开放阅读框架中。
转换几天后，包含表达质粒编码的分离站点感兴趣的菌落将显示可见的荧光，甚至不使用暗读器蓝色透光器。在50毫升离心管中加入10微升甘油的BL21（DE3）细胞，携带表达质粒编码的裂解位点序列，以5毫升LB介质，每毫升安培西林含有100微克。在37度下孵育悬浮液15小时，同时不断摇晃。
将五毫升细菌培养转移到 50 毫升新鲜 LB 培养基，每毫升安西林含有 100 微克。在 600 纳米波长下，以 37 度将细胞长到 0.6 至 0.8 的吸收度。此时，通过添加IPTG来诱导蛋白质表达。
此后，在37度下孵育培养三小时，同时持续摇晃。孵育后，将培养的25毫升转移到清洁的50毫升离心管中，通过离心收获细胞。丢弃上一液，将细菌细胞颗粒储存在零下70度至少一小时。
含有成功表达的荧光蛋白的细胞颗粒清楚地显示荧光，甚至不使用暗读器蓝色透光剂。将冷冻细胞颗粒放在冰上，让它解冻15分钟。向颗粒中加入两毫升解液缓冲液并悬浮细胞。
此后，加入蛋白酶抑制剂，释放利佐齐姆和DNase的悬浮液，悬浮细胞，并在冰上孵育悬浮液15分钟。将两次一毫升悬浮液转移到1.5毫升微离心管中，并在10秒的声波和5秒的断气中对悬浮液进行3分钟的声波化。在室温下以10，000克离心管20分钟。
含有感兴趣的荧光基底的清除细菌细胞的结酸显示可见的荧光，甚至不使用深读器蓝色透光剂。开发蛋白酶测定的程序从制备测定样品开始。首先，用亲和磁珠孵育重组基板，形成基板附着的磁珠，简称为SAMB。
SAMB 被洗涤了几次，最后 SAMB 库存溶液由创建测定样本的等分来准备。通过添加蛋白酶溶液初始化反应。在蛋白酶的裂解下，蛋白酶片段被释放到上经剂中。
该反应通过将磁珠与含有荧光裂解产品和酶的反应缓冲液分离而终止。超钠剂应用于微刺激板的孔中，荧光由荧光测定。校准曲线使用每个测定缓冲液中解解的纯化荧光基板生成。
C-端子荧光裂解产品以及测定样品中应用基板的浓度基于校准曲线的斜率确定。将含有新镍或回收镍-NPA磁性红糖珠的管放在磁性粒子浓缩器中。珠子可以粘在墙壁和/或微离心管的盖子上。
因此，将集中器倒置到每个方向，以确保收集所有珠子。取出上一液并丢弃。向珠子中加入1.8毫升的解液缓冲液，然后从集中器上取出闭合管。
通过摇晃和/或倒置管将磁珠悬浮在管中，直到磁珠完全均匀。将管子放回集中器中，并在每个方向上倒置，以确保收集所有珠子。打开管子并丢弃上一液。
加入含有感兴趣的基质的清除细菌无菌赖于一，并从集中器上取出封闭的管。倒置管，直到珠子完全均匀，在室温下缓慢旋转管子30分钟。SAMB 显示可见的荧光，有甚至不使用暗读器蓝色透光器。
将 SAMB 三次洗涤 1.8 毫升 1%Tween 20、洗涤缓冲液和裂解缓冲液。向洗涤的 SAMB 添加裂解缓冲区以创建 SAMB 库存解决方案。如果使用两毫升蛋白质低结合的微离心管，应用的裂解缓冲液的体积高达1.9毫升。
添加缓冲液后，请勿将管子倒置摇晃或转动。关闭管子并将其从集中器上拆下。为测定样品准备两毫升低结合的微离心管。
暂停 SAMB 库存溶液，直到它完全均匀，并立即将 SAMB 库存溶液转移到样品瓶中，测量反应中要分析的基板量。建议转移 SAMB 库存溶液的体积为 25 到 300 微升，但根据单独的实验设计进行设置。将含有等分 SAMB 悬架的样品管放入集中器中。
小心地从 SAMB 上取下上一液并丢弃它。从集中器上拆下管子，并小心地将反应缓冲液添加到 SAMB 中。添加的反应缓冲液的体积将根据单独的实验设计进行计算，但如果使用两毫升管，建议将反应混合物的最终体积设置为 50 到 150 微升之间。
合上管子的盖子。现在，这些示例已准备好进行初始化。将酶溶液添加到反应样品中。
轻轻移动管子，将管子立即放入已经摇晃的热摇器中，小心地搅拌珠子。在基板空白样品和基板控制样品的情况下，分别添加裂解缓冲液和洗脱缓冲液。在孵化结束前30秒，从热化器中拿出样品，并迅速旋转。
将管子放在集中器上，让管子站立 15 秒。通过稍微来回移动集中器，可以促进 SAMB 的收集。打开盖子，小心地将上一液转移到盘子或新管子中。
请勿在移液器尖端触摸浓缩珠子。基板控制样品和具有高度裂解的反应样品的上流剂可能显示明显的荧光，甚至不使用深读器蓝色透光器。将分离的样品超钠的两次 30 微升转移到黑色半区微孔板中。
根据应用的荧光蛋白，使用适当的过滤器用荧光计测量荧光。对于荧光基板的纯化，请准备与前面所述相同的溶液，并丢弃上流液。向 SAMB 中加入 400 到 600 微升洗脱缓冲液，并在室温下通过旋转器缓慢旋转管，5 分钟。
将埃卢酸盐转移到新的蛋白质低结合微离心管中。它显示清晰可见的荧光与或不使用暗读器蓝色透光器。纯化、缓冲交换和蛋白质含量测量后，在至少八个步骤中准备双重序列稀释，分别从洗脱缓冲液和裂解缓冲液解基质溶液中，使用洗脱或裂解缓冲缓冲液进行稀释。
将每个稀释点的 30 微升转移到黑色半区域微孔板中。使用在测定样品超钠的测量中应用的相同设置，用荧光计测量荧光。作为数据处理的一个例子，HIV-1蛋白酶的基质依赖动力学测量是在重组基质的mTurquoise2-熔融形式上进行的，该基质编码了基质和天然间隙蛋白前体的帽蛋白之间的裂解位点。
根据纯化基材的摩尔浓度绘制校正的相对荧光强度值，求解裂解或洗脱缓冲液，并执行线性回归。使用基于裂解缓冲液的校准曲线的斜率计算反应样品中C-端子裂解产品的摩尔浓度。还要根据基板控制样品中洗脱基板的摩尔浓度，使用基于洗脱缓冲液的校准曲线的斜率，计算反应样品中应用的基板浓度。
初始速度值是根据 C-终端裂解片段的数量计算的，然后根据应用的基板浓度绘制。此外，动力学参数由Michaelis-Menten非线性回归分析确定。在进行镍-NTA磁珠基测定后，也可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析测定超级钠。
然而，除了分析检测样品，也可以分析纯化荧光基板和/或裂解片段后，在溶液消化。对于溶液内消化，将纯化荧光基板消化，溶解在裂解缓冲液中，放入1.5毫升微离心管中，并将酶溶液加入样品中。根据实验设计孵育样品，通过佩奇样品制备程序终止反应。
对于非变性样品制备，将要分析的样品与不含还原剂的非变性样品加载缓冲液混合。在变性样品制备的情况下，将要分析的样品与变性样品加载缓冲液混合，将样品暴露在95度热处理10分钟。将非变性和变性样品放入 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的孔中，并进行电泳。
从正在运行的模块上取下凝胶盒。非变性样品在凝胶中已经可见，即使肉眼或与暗读器蓝色透光剂。为了检测变性样品在转光器上的荧光成分，通过从凝胶中洗出SDS来执行凝胶内重新饱和。
将100毫升蒸馏水加入凝胶中，至少冲洗30分钟。通过将未沾污的凝胶放在暗读器蓝色透光器上，可视化荧光蛋白。重组荧光融合蛋白被设计为在蛋白酶测定中用作基板。
在特定裂解位点由蛋白酶分裂时，释放C-终端荧光裂解片段，并检测其荧光。它们用于镍-NTA磁珠基测定和通过 PAGE分析的荧光检测，已使用HIV-1蛋白酶进行了优化。然而，开发的测定平台也可以适用于其他蛋白酶。
在裂解或洗脱缓冲液中解解的纯化基质的校准曲线，在重组基质编码基质和天然HIV反酶蛋白的帽状蛋白之间的裂解侧mTurquoise2和mEYFP融合形式的例子上进行了说明。镍-NTA磁珠基测定是研究基板浓度对反应速度的影响的有用工具，从而还可以确定Vmax和Km等酶动力学参数。图 A 显示了在 mApple-熔融基材上成功执行基板相关活性分析后获得的最佳结果。
相比之下，图 B 提出了一个次优结果，即 SAMB 库存溶液的均质不足会导致设置适当的基板浓度出现问题，而反应样品的不当端接会导致相对较高的误差。该测定也为进行时间过程和抑制性研究提供了合适的工具。图 A 演示了 HIV-1 蛋白酶在 mEYFP 熔融基材上的时间依赖性，而图 B 则表示安培纳维对裂解反应的抑制作用。
从抑制研究获得的数据中，可以确定活性酶浓度和抑制常数。测定方法也可以进行优化，以研究酶活性对pH的依赖性，因为它以图 A为例，以烟草蚀刻病毒蛋白酶为例。图 B 表示 pH 测定的局限性，表明中性或微碱 pH 与测量完全兼容，而酸性 pH 有助于基板与磁珠表面的自发分离。
本图显示了经过纯化的完好荧光基板，即由HIV-1蛋白酶在溶液内消化产生的荧光C-端裂片段。如果在样品制备过程中应用了非变性条件，可以在电泳后通过蓝光半透明在含有 SDS 的多丙烯酰胺凝胶中检测荧光成分。不同的荧光蛋白可以根据颜色进行区分。
在基于磁珠的测定之后，样品中超酸剂中的非变性荧光蛋白也可以通过紫外线照射在凝胶中检测。相比之下，如果在样品制备过程中应用变性条件，则在 SDS PAGE 之后，无法立即在凝胶中检测到变性蛋白质。然而，变性荧光蛋白可以通过从凝胶中去除SDS来部分重新饱和，并成为可检测的。
因此，SDS PAGE 后面是凝胶内重新饱和过程。荧光蛋白的再饱和能力使得它们不仅能够根据荧光，而且基于其分子量进行鉴定。在这里，我们演示了使用我们最近开发的基于磁珠的荧光蛋白酶测定平台的协议。
在HIV-1蛋白酶酶动力学研究的例子上，我们证明了该系统的使用。我们使用mTurquoise和mApple-熔融形式的重组测定基板，其中包含蛋白酶的裂解位点序列。除了氟学分析外，SDS PAGE还对测定样品进行了分析。
我们已经证明，变性荧光蛋白可以在SDS PAGE后部分在凝胶中重新饱和，从而提供基于荧光和分子量的基板和蛋白解片段的识别。
