白念珠菌实时细胞外通量实时分析的生物能量学研究

该协议对于确定念珠菌的糖解功能和线粒体呼吸非常重要。这项技术的主要优点是，它允许测量线粒体功能，而无需从念珠菌中纯化线粒体。这种方法可以优化，以研究基因操作或化学调制剂对线粒体和糖解通路在坎迪卡白细胞或其他真菌病原体的影响。

这种技术相对简单。或者根据生物体的不同，它们的使用可能有助于优化细胞数量和线粒体抑制剂在测定中的浓度。在层流罩中，将聚-D-Lysine溶解在组织网格水中，最终浓度为每毫升50微克。

将溶液混合好，并放入1.5毫升微离心管中，确保每管至少1.3毫升。将这种混合物的50微升加入检测板的每个井中，盖上盖子，在室温下孵育一到两个小时。然后吸进解决方案。

用500微升无菌组织培养分级水冲洗一次检测板的井，打开盖子，让水井风干。如果不在准备当天使用盘子，请将其存放在四摄氏度，最多存放两到三天。在实验前一天，打开额外的通量检测套件并取出内容物。

将传感器盒倒置放在公用用板旁边。用一毫升的卡兰特填充公用设施板的每个井，然后将传感器盒放回原处。确保含有荧光团的传感器被淹没在卡钳中。

在非二氧化碳培养箱中孵化传感器盒在37摄氏度下过夜。在测定前一天，在YPD汤中接种准备好的C阿尔比肯，并在200转/小时在摇床中以30摄氏度过夜。在测定当天，稀释测定介质中适当数量的细胞，最终浓度为每100微升10万个细胞。

除孔 A1、B4、C3 和 D6 外，将稀释的细胞的 100 微升添加到检测板的每个孔中。在这些井中，仅添加 100 微升的检测介质进行背景校正。在37摄氏度的温度下在非二氧化碳培养箱中孵育60分钟，让细胞粘附在板表面。在文本协议中概述的相应测定介质中，以10倍浓度为线粒体功能测定准备化合物。

将50微升SHAM加入港口，将50微升的Oligomycin加入B端口，将62微升氰化钾加入C端口，将68微升的SHAM加入到D端口中。将50微升葡萄糖加入端口A，将55微升的Oligomycin加入端口B，将62微升的2-DG添加到端口C中，将68微升的抗霉素A添加到端口D中。按照分步说明操作，并填写设置过程中弹出的所有信息。

生成组布局并设置文本协议中概述的协议。在检测之前保存这些布局。在检测时，通过打开检测向导选项卡中的打开文件选项中打开相应的文件来还原保存的协议。

然后将 10X 化合物加载到包含校准器的水合传感器盒的各端口中。将传感器盒加载到额外通量分析仪的托架托盘中。单击屏幕上的"开始"按钮启动校准。

接下来，沿着壁侧的细胞板轻轻添加 350 微升的检测介质，以最大限度地减少细胞干扰，使最终体积达到 450 微升。用检测板更换含有卡钳的实用板，然后继续检测。检测完成后，拆下传感器盒和板。

将文件保存在相应的目标文件夹中。在这项研究中，通过特高量分析仪评估C albicans的生物能量功能。缺乏线粒体蛋白mam33的突变体也包括其补充应变，以研究线粒体蛋白的删除对耗氧率和细胞外酸化率的影响。

C albicans 野生类型显示每分钟 145 个皮莫的耗氧率，这非常在任何细胞外通量测定的最佳范围内。野生型、mam33突变体和mam33互补菌株的基底耗氧率无差异。同样，菌株之间的基底细胞外酸化率没有显著差异。

然而，通过抑制氰化钾的复杂IV，野生型和mam33突变体，mam33补充菌株显示向糖解的重大转变。然而，mam33突变菌株未能显示补偿性糖解移表明复合IV依赖通路在此菌株中受损。在糖解压力测试中，细胞缺葡萄糖一小时，测量基础氧消耗率和细胞外酸化率。

饥饿时，与其他菌株相比，mam33突变菌株的耗氧量和细胞外酸化率显著降低。这表明当细胞被迫进入饥饿状态时，葡萄糖在呼吸和糖解的利用能力下降。注射葡萄糖后，所有菌株的耗氧率和细胞外酸化率均表现出刺激作用。

检测板的涂层允许念珠菌细胞粘附在板上。念珠菌细胞的不当粘附会影响测定结果。在这项技术发展之后，它已被应用于广泛的细胞类型和疾病，解决线粒体在生理和病理条件下的功能。

例如，在此分析中采用患者衍生细胞和控制细胞，可以解决线粒体功能如何改变的具体问题。在制备线粒体抑制剂（如氰化钾和抗霉素 A）时应小心，因为这些化合物具有剧毒性。