Плазменные клетки являются редкими клетками с 30 этапами дифференциации, происходящими в анатомические места, которые ухудшают полную биологическую характеристику, особенно у человека. Наша модель дифференциации плазменных клеток in vitro B2 воспроизводит последовательных клеточных дифференциаций и созревания, происходящих в различных органах in vivo. Эта модель in vitro резюмирует скоординированные транскрипционные изменения и фенотип различных стадий плазменных клеток B2, которые могут быть обнаружены in vivo.
Мы также создали биоинформатические инструменты открытого доступа для анализа наиболее известных информации из данных разведки, связанных с дифференциацией плазменных клеток. Демонстрация процедуры будет Хьюг де Boussac, postdoc из моей лаборатории. Для начала, получить периферические клетки крови от здоровых добровольцев для очистки клеток памяти В.
Разбавить 7,5 миллилитров крови с 24,5 миллилитров RPMI 1640 среды. Затем добавьте 12,5 миллилитров градиента плотности комнатной температуры в стерильную 50-миллилитровую коническую трубку. Аккуратно наложить градиент плотности с 32 миллилитров разбавленной крови, убедившись, чтобы свести к минимуму смешивание двух фаз.
Центрифуга в течение 20 минут при 500-времени тяжести с выключенным тормозом. Соберите периферические моноядерные клетки крови из разбавленного интерфейса градиента плазмы и плотности. Перенесите клетки в стерильную 50-миллилитровую трубку и заполните трубку до 45 миллилитров сбалансированным соленым раствором Хэнка.
Центрифуга при 500-времени гравитации в течение пяти минут. Аккуратно удалите супернатант и держите гранулы. Затем добавьте 45 миллилитров rpMI 1640 среды, дополненные 10%FCS.
Центрифуга при 500-времени гравитации в течение пяти минут. Аккуратно удалите супернатант и держите гранулы. Добавьте 30 миллилитров PBS, дополненных 2%FCS.
Используйте анти-CD магнитные бусы для удаления CD2-положительных клеток, добавив четыре бусинки для одной целевой ячейки. Инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение 30 минут. Используя магнит для приложения разделения клеток, отделяйте клетки, связанные бисером, от неограниченных ячеек.
Соберите неограниченные клетки и инкубировать их анти-CD19 APC и анти-CD27 PE антител в течение пятнадцати минут при четырех градусах по Цельсию. Вымойте клетки дважды в PBS, содержащий 10%goat сыворотки. Затем используйте сортер клеток, чтобы очистить клетки памяти В до 95%чистоты.
После этого добавьте растворимые лиганд CD40 и анти-полихистидин моноклональные антитела для активации клеток памяти В. Плита очищенных клеток памяти В в шести-хорошо культуры пластин в течение четырех дней с интерлеукин-2, интерлеукин-10 и интерлеукин-15. Для профилирования экспрессии генов используйте сортер клеток для очистки CD38-отрицательных преплазмабластов CD20 на четвертый день.
На четвертый день, подсчитайте клетки и пластины их в 12-хорошо культуры пластин при плотности клеток 250000 клеток на миллилитр, добавив два миллилитров клеточной суспензии в каждой хорошо. Чтобы вызвать дифференциацию, удалите олигонуклеотиды CPG и растворимый лиганд CD40 и добавьте новую культурную среду, содержащую новый цитокиновый коктейль, включающий интерлейкин-2, интерлеукин-6, интерлеукин-10 и интерлеукин-15. Культура клеток в течение трех дней при 37 градусах по Цельсию.
Для профилирования экспрессии генов используйте сортер клеток для очистки CD38-положительных плазменныхбластов CD20 на седьмой день. На седьмой день посчитайте камеры. Плита клеток в 12-хорошо культуры пластин при плотности клеток 500000 клеток на колодец, добавив два миллилитров клеточной подвески к каждой хорошо.
Дифференцируйте плазменные пластины на ранние плазменные клетки, используя свежую культурную среду, содержащую интерлеукин-6, интерлеукин-15 и интерферон-альфа в течение трех дней при 37 градусах Цельсия. Для профилирования экспрессии генов используйте сортер клеток для очистки CD20-отрицательных, CD38-положительных, CD138-положительных ранних плазменных клеток в день 10. Во-первых, культура стромальных клеток в течение пяти дней с культурой среды.
Используйте 0,2-микролитровый фильтр для фильтрации стромальной клеточной культуры супернатанта для получения стромальной клетки кондиционированной среды и заморозить до готовности к использованию. Далее, культура ранних плазменных клеток в 12-хорошо культуры пластин, используя ранее полученные стромальные клетки среды с интерлейкин-6 и APRIL при плотности клеток 500000 клеток на колодец, добавив два миллилитров клеточной суспензии к каждой хорошо. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию, обновляя стромальные клетки кондиционированной среде каждую неделю.
Затем измерьте секрецию иммуноглобулина из цитометрии потока отсортированных плазменных клеток. Культура плазменных клеток при плотности одного миллиона клеток на миллилитр в течение 24 часов и урожай культуры supernatant. Используя комплект ELISA, измерьте иммуноглобулин G и иммуноглобулин A.First, запустите веб-инструмент GenomicScape открытого доступа к биоинформатике.
В меню данных просмотра выберите набор данных, названный клетками группы В человека, в плазменные клетки. Визуализация профиля экспрессии генов уникального гена или списка генов доступна с помощью инструмента Expression/Coexpression Report в инструментах анализа. Далее выберите Analysis Tools webSAM для загрузки инструмента SAM.
Выберите человеческие В-клетки для набора данных плазменных клеток и выберите группу образцов для сравнения. Используйте различные фильтры, доступные для применения вариантов фильтрации, представляющих интерес. Чтобы сравнить профили экспрессии генов с инструментом SAM, измените параметры фильтрации, включая изменение складок, количество перестановок, скорость ложных открытий и тип сравнения.
Программное обеспечение будет вычислять анализ и предоставлять гены, дифференцированно выраженные между выбранными группами. В этом исследовании исследованы экспрессионные изменения эпигенетических факторов в нормальной дифференциации плазменных клеток. Используя многоклассный анализ SAM, 71 ген, как видно, значительно дифференциально выражен между клетками памяти В, преплазмабласты, плазмабласты, ранние плазматические клетки и плазменные клетки костного мозга с ложной скоростью открытия менее 5%Стадия В-клеток памяти характеризуется переэкспрессией 23 генов эпигенетических игроков, в том числе 39,13% гистона ацетилтрансферазы, 30,43% его метилтрансферазы , 21,74% деметилаза гистона, 4,35% метил связывающих белков и 4,35% деацетилаз гистона.
14 генов эпигенетических игроков значительно переэкспрессированы на стадии преплазмабласта, в том числе 50% гистона метилтрансферазы, 14,28% метилтрансфераз ДНК, 21,43% гистона деацетилазы, 7,14% гистона деметилазы, и 17,14% гистонов ацетилтрансаза. После этой процедуры, несколько анализов для выявления и понимания изменений в структуре хроматина и архитектуры во время этих B2 дифференциации плазменных клеток может быть выполнена. Эта модель дифференциации in vitro позволит генерировать достаточное количество клеток для завершения этого молекулярного анализа, чтобы выявить как пути, участвующие во всем этом моделировании, так и их влияние транскрипции ниже по течению во время дифференциации плазменных клеток B2.
Эти знания, полученные в результате этого исследования может информировать и инструктировать по диагностическим и терапевтическим стратегиям для плазменных клеток расстройств, таких, как в случае множественной миеломы, рак без окончательного лечения, для которого лучше прогноз и улучшение терапевтических стратегий крайне необходимы. Особый интерес представляет характеристика и понимание эпигенетических ремоделирования структурных и архитектурных изменений, влияющих на хроматин при дифференциации плазменных клеток В2. Это можно сделать с помощью секвенирования генов, ERRBS, секвенирования ATAC, IC и секвенирования РНК.
Умеренная неоднородность может наблюдаться в процентном соотношении активированных В-клеток, преплазмабластов, плазменныхбластов и плазменных клеток, в зависимости от крови здорового донора, используемой для очистки клеток памяти В.
