خلايا البلازما هي خلايا نادرة مع 30 مراحل التمايز التي تجري في المواقع التشريحية التي تضعف التوصيف البيولوجي الكامل، وخاصة في الإنسان. لدينا في المختبر B2 نموذج تمايز الخلايا البلازما يستنسخ تمايز الخلية التسلسلية والنضج التي تحدث في الأجهزة المختلفة في الجسم الحي. هذا النموذج في المختبر يلخص التغيرات المنسّقة النسخي و النمط الظاهري لمراحل خلايا البلازما B2 المختلفة التي يمكن اكتشافها في الجسم الحي.
كما قمنا ببناء أدوات المعلوماتية الحيوية المفتوحة لتحليل أبرز المعلومات من بيانات الاستكشاف المتعلقة بتمايز خلايا البلازما. إثبات الإجراء سيكون هوغس دي Boussac، وهو ما بعد الدكتوراه من مختبري. للبدء، الحصول على خلايا الدم الطرفية من المتطوعين الأصحاء لتنقية الذاكرة الخلية B.
تمييع 7.5 ملليلتر من الدم مع 24.5 ملليلتر من 1640 1640 1640 متوسطة. بعد ذلك، أضف 12.5 ملليلتر من تدرج كثافة درجة حرارة الغرفة إلى أنبوب مخروطي معقم يبلغ 50 ملليلتر. تراكب بلطف تدرج الكثافة مع 32 ملليلتر من الدم المخفف، مع التأكد من تقليل اختلاط المرحلتين.
جهاز طرد مركزي لمدة 20 دقيقة في 500 مرة الجاذبية مع الفرامل قبالة. جمع خلايا أحادية النوى الدم الطرفية من البلازما المخففة وكثافة واجهة الانحدار. نقل الخلايا إلى أنبوب 50 ملليلتر معقمة وملء أنبوب يصل إلى 45 ملليلتر مع هانك حل الملح المتوازن.
جهاز طرد مركزي في 500 مرة الجاذبية لمدة خمس دقائق. إزالة بعناية فائقة والحفاظ على بيليه. ثم، إضافة 45 ملليلتر من 1640 1640 متوسطة، وتستكمل مع 10٪ FCS.
جهاز طرد مركزي في 500 مرة الجاذبية لمدة خمس دقائق. إزالة بعناية فائقة والحفاظ على بيليه. إضافة 30 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، تستكمل مع 2٪ FCS.
استخدم الخرز المغناطيسي المضاد للقرص المضغوط لإزالة الخلايا الإيجابية CD2 عن طريق إضافة أربعة خرزات لخلية هدف واحدة. احتضان أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. باستخدام مغناطيس لتطبيق فصل الخلية، قم بفصل الخلايا المنضمة للخرز عن الخلايا غير المنضمة.
جمع الخلايا غير المنضمة واحتضان لهم مع المضادة لCPC CD19 ومضادات CD27 PE لمدة خمس عشرة دقيقة في أربع درجات مئوية. غسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني يحتوي على مصل الماعز 10٪. ثم، استخدم فارز الخلية لتنقية خلايا الذاكرة B إلى نقاء 95٪.
بعد ذلك، أضف ليغاند CD40 قابل للذوبان ومضادة للبولي هيستيدين أحادية النسيلة لتنشيط الخلية B الذاكرة. لوحة الخلايا B الذاكرة النقية في لوحات ثقافة ستة بئر لمدة أربعة أيام مع إنترلوكين-2، interleukin-10 وإنرلوكين-15. للحصول على التنميط التعبير الجيني، استخدم فارز الخلية لتنقية CD38-سالبة CD20-سالبة preplasmablasts في اليوم الرابع.
في اليوم الرابع، عد الخلايا وطبقها في لوحات 12-جيدا ثقافة في كثافة خلية من 250، 000 خلية لكل ملليلتر عن طريق إضافة ملليلتر اثنين من تعليق الخلية في كل بئر. للحث على التمايز، وإزالة oligonucleotides CPG والذوبان CD40 ليغاند وإضافة ثقافة جديدة المتوسطة التي تحتوي على كوكتيل السيتوكين جديدة بما في ذلك interleukin-2، إنترلوكين-6، إنترلوكين-10 وانتلوكين-15. ثقافة الخلايا لثلاثة أيام في 37 درجة مئويّة.
بالنسبة لتحديد صورة التعبير الجيني، استخدم فارز الخلية لتنقية الأرومية البلازما CD38-positive، CD20-negative في اليوم السابع. في اليوم السابع، عد الخلايا. لوحة الخلايا في لوحات ثقافة 12-جيدا في كثافة الخلية من 500،000 الخلايا في البئر، عن طريق إضافة مليلترين من تعليق الخلية إلى كل بئر.
ميز البلازما في خلايا البلازما المبكرة باستخدام وسط الثقافة الطازجة التي تحتوي على interleukin-6، interleukin-15، وانترفيرون ألفا لمدة ثلاثة أيام في 37 درجة مئوية. بالنسبة لتحديد صورة التعبير الجيني، استخدم فارز الخلية لتنقية خلايا البلازما المبكرة CD20-سالبة، وD38-positive، وD138 إيجابية في وقت مبكر من البلازما في اليوم 10. أولاً، الخلايا التهيّة الثقافية لخمسة أيام مع ثقافة متوسطة.
استخدام مرشح 0.2 ميكرولتر لتصفية عظمى ثقافة الخلية stromal للحصول على خلية ال stromal مشروطة المتوسطة وتجميد حتى جاهزة للاستخدام. بعد ذلك ، ثقافة خلايا البلازما في وقت مبكر في لوحات ثقافة 12-well ، وذلك باستخدام خلية السترومال المتوسطة التي تم الحصول عليها سابقًا مع interleukin-6 و APRIL بكثافة الخلايا من 500،000 خلية في البئر ، عن طريق إضافة ميليلترين من تعليق الخلايا إلى كل بئر. احتضان في 37 درجة مئوية، وتجديد الخلية القوية مكيفة المتوسطة كل أسبوع.
ثم, قياس إفراز الغلوبولين المناعي من تدفق خلايا البلازما فرز الخلايا. زراعة خلايا البلازما بكثافة مليون خلية لكل ملليلتر لمدة 24 ساعة وحصاد الثقافة فائقة. باستخدام مجموعة ELISA ، وقياس G المناعية ، والغلوبولين المناعي A.First ، وإطلاق GenomicScape الوصول المفتوح أداة المعلوماتية الحيوية على شبكة الإنترنت.
في قائمة بيانات الاستعراض، حدد مجموعة البيانات المسماة خلايا B البشرية إلى خلايا البلازما. يمكن تصور ملف تعريف التعبير الجيني لجين فريد أو قائمة من الجينات باستخدام أداة تقرير التعبير/Coexpression في أدوات التحليل. بعد ذلك، حدد أدوات التحليل webSAM لتحميل أداة SAM.
اختيار خلايا B الإنسان إلى مجموعة البيانات خلايا البلازما وحدد مجموعة من العينات للمقارنة. استخدم عوامل التصفية المختلفة المتوفرة لتطبيق خيارات التصفية ذات الأهمية. لمقارنة ملفات تعريف التعبير الجيني مع أداة SAM، قم بتعديل خيارات التصفية بما في ذلك تغيير الطي، وعدد التباديل، ومعدل الاكتشاف الزائف، ونوع المقارنة.
وسيحسب البرنامج التحليل ويوفر جينات معبّر عنها بشكل تفاضلي بين المجموعات المختارة. في هذه الدراسة، يتم التحقيق في التغيرات التعبير من العوامل اللاجينية في تمايز الخلايا البلازما العادية. باستخدام تحليل سام متعدد الفئات، وينظر إلى 71 الجينات التي أعرب عنها بشكل تفاضلي كبير بين الخلايا B الذاكرة، وpreplasmablasts, البلازماblasts, خلايا البلازما في وقت مبكر وخلايا البلازما نخاع العظم مع معدل اكتشاف زائف من أقل من 5٪ تتميز مرحلة الخلية ب الذاكرة من قبل overexpression من 23 الجينات لاعب اللاجينية, بما في ذلك 39.13٪ من acetylferases هيستون, 30.43٪ من ميثيل ميثيل ، 21.74٪ من الهستون ديميثيلاسيس، 4.35٪ من بروتينات الميثيل الملزمة، و 4.35٪ من الهستون ديسيتيلاس.
14 الجينات لاعب اللاجينية هي overexed بشكل كبير في مرحلة preplasmablast، بما في ذلك 50٪ من ميثيل ترانسفيراسيس هيستون، 14.28٪ من الحمض النووي DNA methyltransferases، 21.43٪ من deacetylases هيستون، 7.14٪ من الهستون demethylases، و 17.14٪ من اسيتيلفيرانس هيستون. وبعد هذا الإجراء، يمكن إجراء عدة تحليلات لتحديد وفهم التعديلات في بنية الكروماتين والهندسة أثناء هذه التمايزات في خلايا البلازما B2. هذا النموذج التمايز في المختبر سيسمح لتوليد ما يكفي من الخلايا لإكمال هذا التحليل الجزيئي للكشف عن كل من المسارات المشاركة في هذا النمذجة بأكملها وتأثيرها النسخي المصب خلال تمايز خلية البلازما B2.
هذه المعرفة المستمدة من هذا البحث يمكن أن ترشد وترشد الاستراتيجيات التشخيصية والعلاجية لاضطرابات خلايا البلازما، كما هو الحال في حالة المايلوما المتعددة، وهو سرطان بدون علاج نهائي، والتي هناك حاجة ماسة إلى تحسين التشخيص وتحسين الاستراتيجيات العلاجية. وصف وفهم التغيرات الهيكلية والمعمارية إعادة عرض اللاجينية التي تؤثر على الكروماتين خلال B2 تمايز خلية البلازما تكون ذات أهمية خاصة. ويمكن القيام بذلك باستخدام تسلسل الجينات ، ERRBS ، تسلسل ATAC ، IC ، و RNA التسلسل.
ويمكن ملاحظة عدم تجانس معتدل في النسبة المئوية لخلايا B المنشطة، والخلايا البلازمية، وخلايا البلازما، اعتمادا على دم المتبرع السليم، المستخدم في تنقية الخلايا ب الذاكرة.
