我们诚恳地感谢克莱门斯Wendtner博士提供tmuCD40配体HeLa细胞株。

协议分为两个部分：第一部分为一代小鼠CD40激活的B细胞（脾mCD40B）一个演示小鼠CD40配体（CD40L）表达HeLa细胞（tmuCD40L HeLa细胞），这将被用作板准备束缚饲养层细胞。 B部分介绍了实际的小鼠CD40 - B的文化。 A.制备饲养细胞（HeLa细胞tmuCD40L） tmuCD40L HeLa细胞是一个附着的人类上皮细胞系，这不应该成为完全融合。因此，这些细胞被劈裂每周两次。超过6周以上的培养，不推荐。 <ol><li>从小学文化的老媒体取出，用无菌吸管和10 mL 1X PBS中洗细胞。吸的PBS洗涤后。 </li><li>添加4毫升1X胰蛋白酶/ EDTA，在一个75厘米的 2瓶10-15分钟，在37 ° C。使用温柔攻分离的细胞。 </li><li>野生型中添加10毫升，并轻轻旋转停止用胰酶消化。 </li><li>转移到50 mL试管细胞悬液，用无菌吸管和旋转265 7分钟XG的细胞。 </li><li>去除上清，重悬细胞沉淀在野生型中的10毫升。计数细胞悬液等分的细胞数，并准备适当数量的细胞50毫升管： <ol><li> 2.5 × 10 6细胞对亚文化</li><li> 0.4 × 10 6细胞/孔照射小鼠CD40 - B细胞培养使用</li><li>其余冻结（如需要）。 </li></ol></li><li>旋转细胞在265 7分钟XG。 </li><li>去除上清。 <ol><li>传代培养：重悬于2.5 × 10 6细胞10毫升，75厘米2细胞培养瓶中的选择培养基（细胞密度为2.5 × 10 5细胞/ mL）孵育细胞在37℃，5％的CO 2 。每周两次分裂的细胞。 </li><li>对于小鼠CD40 - B细胞文化：您需要2.4 × 10 6 6孔板细胞。在野生型中重悬tmuCD40L HeLa细胞密度0.2 × 10 6细胞/ mL，他们在78 Gy的照射。板2毫升细胞悬液，每口井，并在37℃，5％的CO 2。使用B -细胞的刺激，这准备板块tmuCD40L HeLa细胞是贴壁时（至少4个小时：用显微镜检查坚持;不要等到超过24 h开始的B细胞刺激）。 （继续与B） </li></ol></li></ol> B.小鼠CD40 - B细胞培养一，制备脾细胞CD40的刺激（0天）： 请注意：在继续之前确定，饲养层细胞是贴壁。随时添加新的解决办法小鼠白细胞介素- 4，β-巯基乙醇和环孢素A的生长介质，使用前。 <ol><li>剖析的C57BL / 6小鼠（H - 2B单体）的脾和10-20毫升的DMEM洗两次辅以庆大霉素[15μg/mL]一个10毫升吸管尖从一个管到另一个传输。避免使用鼠标的传输污染物（例如头发）。切碎脾细胞通过一个过滤器（100微米）通过，并与其他10毫升的中型冲洗过滤器。降速在室温下为7分钟在265 XG脾，重悬在7ML muCD40 - B细胞中，并Ficoll密度离心分离淋巴细胞。没有在室温下刹车，这样做的5毫升鼠标Pancoll（在室温预热）在15毫升管和离心30分钟XG 450层细胞。 </li><li>绘制关闭最上层，离开淋巴细胞在界面层不受干扰。淋巴细胞层转移到一个新的50 mL试管中，用30毫升，庆大霉素[15μg/mL] DMEM培养液一旦被旋转265 7分钟XG删除其他细胞。弃上清，重悬细胞mCD40 - B的清洗介质在10毫升的。确定细胞的细胞悬液分装数。确定由计数的细胞悬液等分细胞数。 </li><li>离心7分钟在265 XG的细胞所需的金额。对于6孔板5 × 10 6细胞/孔的需要，因此30 × 10 6细胞每盘。 </li><li>取出上清液，重悬mCD40 - B的文化与1 U /白细胞介素4毫升新鲜培养基中的淋巴细胞，在1.25 × 10 6细胞/ mL，生长因子，100微米，β-巯基乙醇和0.63微克/毫升，环孢素A，以防止T细胞的生长（由于浓度是指一毫升培养液！）。 </li><li>取出从6孔板与tmuCD40L HeLa细胞预孵育中的上清。 </li><li>轻轻地添加4毫升的淋巴细胞悬液（1.25 × 10 6细胞/ mL）以及每6孔板。 </li><li>板在37℃，5％的CO 2。 </li&gt; <li>第3天reculture细胞（二.1继续）。 </li></ol>二。 mCD40B细胞传代培养的（第3天，然后每周两次）： <ol><li>收获mCD40B大力移液10毫升到50毫升管的移液器和池他们向上和向下的细胞群。 </li><li>离心7分钟在265 XG，并完全取代mCD40 - B的清洗介质的上清。虽然计数细胞数量的等分，旋转265 XG细胞为7分钟。 mCD40B悬浮细胞mCD40 - B的培养基中，在0.75 × 10 6细胞/ ml的浓度。 </li><li>小鼠白细胞介素4的新鲜的解决方案中添加一个1 U /毫升，100μMβ-巯基乙醇和0.63μg/ mL的中期环孢素A的浓度。 </li><li>取出从6孔板与照射tmuCD40L HeLa细胞预孵育中的上清。 </li><li>轻轻地添加4毫升每6孔板以及mCD40B细胞悬液（0.75 × 10 6细胞/ mL）。 </li><li>孵育板在37℃，5％的CO 2。 </li><li>再次传代培养的细胞，每隔3-4天，以高纯度的小鼠CD40的B细胞激活后的14天总。 </li></ol> C.故障排除：CD40的B细胞，如果不长呢？ <ol><li>你有检查饲养层细胞的CD40的配体表达？ </li><li>板约束馈线用于刺激超过24h以上的细胞？ </li><li>是否有支原体污染吗？ </li><li>是白细胞介素- 4解决方案，为补充新鲜解冻，并有相应的生物活性？ </li><li>是β-巯基乙醇和环孢素A中添加正确的浓度？ </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1a.jpg" alt="图1" /> 图1a。 <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1b.jpg" alt="图1 B" /> 图1b。 <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1d.jpg" alt="图1 D" /> 图1d。 <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig2.jpg" alt="图2" /> 图2。

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	<li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+human+B+cells:+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).</li><li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation.">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+using+retrovirally+transduced+CD40-activated+B+cells.">Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.</a> J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).</li><li>Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+CD40-activated+B+cells.">Generation of human CD40-activated B cells.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li><li>von Bergwelt-Baildon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis:+potential+as+cellular+adjuvants.">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).</li><li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells.">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).</li><li>Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+Ligand-activated,+antigen-specific+B+cells+are+comparable+to+mature+dendritic+cells+in+presenting+protein+antigens+and+major+histocompatibility+complex+class+I-+and+class+II-binding+peptides.">CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides.</a> Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).</li><li>Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells:+potential+for+clinical+application.">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients:+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential.">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).</li><li>Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCs+and+CD40-activated+B+cells:+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy.">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+translocations+are+associated+with+poor+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 107 (2), 742-751 (2006).</li><li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma.">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).</li></ol>

实验是按照实验动物饲养的国家和欧洲的指引。在谈到德国的动物福利法，动物是由当局控制的定期的。

本协议的修改是可能的，尤其是关于CD40的刺激和使用的小鼠品系类型的起源，也高产高效代小鼠CD40激活的B细胞。艾哈迈迪等人。表明小鼠CD40的配体转染小鼠成纤维细胞类似的结果。可以肯定地排除在这种异种抗原的背景下演示，但在体内的安全性和毒性的深入研究了在此设置使用人类转染的HeLa细胞的炎症或自身免疫反应的迹象。然而，最好的替代代表与激活和增殖活动在同一时间，这?...

A.媒体的制备： <table border="1"><tbody><tr><td> 直属细胞野生型中 </td><td> 馈线小区选择培养基 </td><td></td></tr><tr><td> 试剂 </td><td> 集中 </td><td> 试剂 </td><td> 集中 </td></tr><tr><td> RPMI 1640培养</td><td></td><td> RPMI 1640培养</td><td></td></tr><tr><td> L -谷氨酰胺</td><td> 300微克/毫升</td><td> L -谷氨酰胺</td><td> 300微克/毫升</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td> 10％ </td><td>胎牛血清</td><td> 10％ </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10毫米</td><td> HEPES </td><td> 10毫米</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td> 15微克/毫升</td><td>庆大霉素</td><td> 15微克/毫升</td></tr><tr><td></td><td></td><td>潮霉素B </td><td> 0.2毫克/毫升。 </td></tr></table><table border="1"><tbody><tr><td> mCD40 - B的清洗介质 </td><td> mCD40 - B的培养基 </td></tr><tr><td> 试剂 </td><td> 集中 </td><td> 试剂 </td><td> 集中 </td></tr><tr></tr><tr><td> D - MEM </td><td> </td><td> D - MEM </td><td> </td></tr><tr><td> L -谷氨酰胺</td><td> 580微克/毫升</td><td> L -谷氨酰胺</td><td> 580微克/毫升</td></tr><tr><td>血糖</td><td> 4.5毫克/毫升</td><td>血糖</td><td> 4.5毫克/毫升</td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10毫米</td><td> HEPES </td><td> 10毫米</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td> 15微克/毫升</td><td>庆大霉素</td><td> 15微克/毫升</td></tr><tr><td> </td><td> </td><td>纪念</td><td> 0.1MM（1X） </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td>胎牛血清</td><td> 10％ </td></tr></tbody></table> B.其它试剂： <table border="1"><tr><td> 试剂 </td><td> 公司 </td><td> 订单号 </td></tr><tr><td> RPMI 1640培养</td><td> Invitrogen公司Gibco公司</td><td>楼盘21875 </td></tr><tr><td> D - MEM </td><td> Invitrogen公司Gibco公司</td><td>楼盘41965 </td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS（10X） </td><td>临时机场管理局</td><td>猫没有H15 - 011 </td></tr><tr><td> Gencin </td><td>三角洲选择</td><td>货号7395800 </td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>龙沙</td><td>猫没有DE14 - 802C </td></tr><tr><td> HEPES缓冲液</td><td>临时机场管理局</td><td>猫没有S11 - 001 </td></tr><tr><td> MEM NEAA </td><td> Invitrogen公司Gibco公司</td><td>楼盘11140 </td></tr><tr><td>潮霉素B </td><td>临时机场管理局</td><td>猫没有P02 - 015 </td></tr><tr><td>重组小鼠白细胞介素4 </td><td> Immunotools </td><td> CAT无12340045 </td></tr><tr><td>环孢素A </td><td>诺华公司</td><td>猫没有NDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td>胰蛋白酶/ EDTA（10X） </td><td> Invitrogen公司Gibco公司</td><td>楼盘15400-054 </td></tr></table> C.杂项用品： <table border="1"><tbody><tr><td> 试剂 </td><td> 公司 </td><td> 订单号 </td></tr><tr><td>无菌移液器</td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6孔板</td><td> NUNC </td><td> CAT没有140675 </td></tr><tr><td> 50毫升锥形管</td><td> BD猎鹰™ </td><td> CAT没有352070 </td></tr><tr><td>组织培养瓶</td><td> Sarstedt </td><td> CAT没有83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

murine model of cd40-activation of b cells

有研究表明，B细胞CD40的激活提高其抗原提呈能力。当白细胞介素4和CD40配体（CD40L）的刺激下，没有非常大量高纯度的CD40 - B细胞（14天之内的困难，从少量外周血的可扩展人类B细胞&gt; 10<sup&gt; 9</sup&gt;细胞每名患者），从健康的捐赠者以及癌症患者<sup&gt; 1-4</sup&gt;。 CD40 - B细胞表达重要的淋巴结归巢的分子，可以吸引T细胞<em&gt;在体外</em<sup&gt; 5</sup&gt;。此外，他们采取有效，过程和目前的T细胞抗原<sup&gt; 6,7</sup&gt;。 CD40 - B细胞被证明不仅总理天真，但也扩大记忆性T细胞<sup&gt; 8,9</sup&gt;。因此，CD40 -激活的B细胞（CD40 - B细胞）进行了研究，作为一种替代源免疫刺激抗原提呈细胞（APC），基于细胞immunotherapy1，5,10。为了进一步研究是否CD40 - B细胞诱导有效的T细胞在体内的反应和我们建立了小鼠CD40激活的B细胞产生的细胞培养系统研究的基础机制。使用脾细胞或纯化C57BL / 6小鼠的B细胞CD40的激活，确定了最佳工艺条件如下：开始的C57BL / 6小鼠淋巴细胞（单体型H - 2B）的脾细胞密度梯度离心法和HeLa细胞共同培养纯化重组鼠CD40配体（tmuCD40L的HeLa细胞表达）<sup&gt; 11</sup&gt;。细胞是再培养每隔3-4天，和关键部件，如CD40L，白细胞介素- 4 -巯基乙醇和环孢素A的补充。在这个协议中，我们演示了如何获得类似的APC -表型的人CD40 B细胞（图1A，B）完全激活的小鼠的CD40 - B细胞（mCD40B）。 CD40的刺激会导致快速的生长和细胞培养在14天的高纯度（&gt; 90％），CD19 + B细胞的扩张（图1C，D）​​。为了避免污染与非转染的细胞，小鼠CD40的配体的转染表达经常被控制（图2）。小鼠CD40激活的B细胞可用于研究B细胞的活化和分化，以及调查他们的潜能作为APC，在体内和体外的功能。此外，他们代表了建立抗肿瘤治疗或预防接种有前途的工具，将有助于回答问题，这种方法的安全性和免疫原性<sup&gt; 12</sup&gt;。

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Murine Model of CD40-activation of B cells

在这个视频中，我们展示的CD40从C57BL / 6小鼠的脾细胞，它可以用来作为模型抗原提呈细胞（APC）的研究免疫诱导小鼠的B细胞的活化和扩大的过程。

激活的B细胞CD40的小鼠模型

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

murine-model-of-cd40-activation-of-b-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.5K 次观看.  University Hospital of Cologne. 在这个视频中，我们展示的CD40从C57BL / 6小鼠的脾细胞，它可以用来作为模型抗原提呈细胞（APC）的研究免疫诱导小鼠的B细胞的活化和扩大的过程。