基于细菌选择和生长的盘状细胞基因工程

该协议的价值是，它允许几乎任何菌株的二钙化物被分子遗传学操纵，无论该菌株是否会在液体介质中轴性地生长。这种技术的另一个优点是，它快速而简单。在开始混合细胞核糖核酸之前，先将转染细胞与异细胞质粒转置。

结果已经可以使用显微镜在转染两天后进行验证。与细胞和细菌悬浮液一起工作是不寻常的。可视化将有助于让实验者了解如何执行协议的不同步骤。

与我展示这个程序的将是苏达贝·伊马尼基亚，一个来自我实验室的博士后。首先，根据文本协议，准备1000毫升的索伦森缓冲液，用氯化镁和氯化钙。在此之后，使用单一的K气基因群体来接种一升LB介质。

让细菌在37摄氏度下一夜之间随着震动而生长。将细胞旋转到两个500毫升的离心管中，以收获细胞。然后，用500毫升的缓冲液清洗细菌一次。

将颗粒重新在20毫升缓冲液中。使用光度计检查样品的光学密度，并使用缓冲液稀释样品，直到光学密度约为 100。在此之后，根据文本协议准备H40电穿孔缓冲液。

生长K气基因，在室温下隔夜汇合SM介质。将 400 微升的细菌悬浮液加入 SM agar 板中，并均匀分布。然后，采取一个无菌循环，并接种它与脂肪细胞和蔓延细胞在板的一边缘。

在22摄氏度下孵育两天，以确保生长区足够大，足以转染。在10厘米组织培养处理的培养皿中加入10毫升K气基因悬浮液。然后，使用10微升一次性接种循环从培养板的生长区刮取细胞。

将细胞转移到1.5毫升管，含有冰冷的H40缓冲液。在10000倍的重力下旋转细胞两秒钟。然后，丢弃上流水，重新在H40缓冲液中重新暂停细胞。

接下来，将100微升的细胞加入一个含有1到2微克DNA的管子中。上下移液，将细胞DNA混合物混合并转移到预冷却的电穿孔盒中。不要添加超过两微克的DNA。

较高的DNA浓度对细胞有毒，降低效率。电穿孔后，立即将细胞转移到准备好的10厘米培养皿中，使细胞恢复5小时。要选择一个转染剂进行敲出、敲击或行为五敲合，请通过将液体移液在表面上将细胞从培养皿中分离出来。

然后，根据文本协议对选择性剂进行三次稀释。最后，将150微升的已准备稀释液分配到96孔平底组织培养板的每孔中。在该协议中，演示了双处理器外体质粒系统。

转染32小时后，大多数细胞都表示两种荧光标记的融合蛋白。还尝试了一个行为五 M 樱桃敲击和 NC4 。在阿加罗斯凝胶上运行消化后，获得了两个波段。

4127 基对带包含所需的构造。纯化DNA用于NC4细胞的转染。通过PCR对NC4转染的两个克隆进行了分析，并显示了预测的带模式。

然后使用南方印迹来验证PCR的结果。NC4在细菌草坪上的生长速度比 Ax2 细胞快。四个小时后，更多的NC4细胞能够爬下阿加罗斯比斧头2细胞。

NC4细胞比Exx2细胞更快，对叶酸表现出更强的化疗反应。始终使用刚设置的 SM 板中的细胞。切勿使用超过四天的单元格，否则效率会下降。

新鲜隔离的，无下层，白色HAP菌株通常用于解决有关口述或社会行为的问题。我们允许通过这些分离物应用分子遗传学。