このプロトコルの価値は、その株が液体培地で無比に成長するかどうかに関係なく、ジクチオステリウム・ディスコジウムのほぼすべての株を分子遺伝学によって操作することができるということです。この手法のもう 1 つの利点は、高速で簡単なことです。ジクチオステリウムを混合し始める前に、エキソコモソームプラスミドを用いてトランスフェクト細胞に移調する。
結果は、顕微鏡を使用してトランスフェクションの2日後に既に検証することができます。ジクチオステリウム細胞や細菌懸濁液で動作することは珍しいです.視覚化は、実験者に、プロトコルの異なるステップがどのように実行されているかを知るのに役立ちます。
私と一緒に手順を実証することは、私の研究室のポスドクであるSoudabeh Imanikiaです。まず、テキストプロトコルに従って、1000ミリリットルのソレンセンバッファーを、塩化マグネシウムと塩化カルシウムで処理液を調製します。この後、1リットルのLB培地を接種するためにKエアロゲネスの単一コロニーを使用する。
細菌が揺れで摂氏37度で一晩成長することを許可します。細胞を収穫するために2つの500ミリリットル遠心管で細胞を回転させます。その後、500ミリリットルの緩衝液で細菌を1回洗う。
ペレットを20ミリリットルのバッファーに再懸濁します。光量計を使用してサンプルの光学濃度を確認し、光学密度が約100になるまでサンプルをバッファーで希釈します。この後、テキストプロトコルに従ってH40エレクトロポレーションバッファを準備します。
室温で一晩SM培地を合流させるためにKエアロゲネスを成長させます。400マイクロリットルの細菌懸濁液をSM寒天プレートに加え、均等に広げます。次いで、滅菌ループを取り、ジクチオステリウム細胞で接種し、プレートの片端に細胞を広げます。
成長ゾーンがトランスフェクションに十分な大きさであることを確認するために、2日間摂氏22度でプレートをインキュベートします。10センチメートルの組織培養ペトリ皿にKエアロジーン懸濁液の10ミリリットルを加えます。次いで、10マイクロリットルの使い捨て接種ループを用いて、培養プレートの成長ゾーンから細胞を掻き取る。
細胞を氷冷H40バッファーを含む1.5ミリリットルチューブに移します。重力10000倍で細胞を2秒間回転させます。その後、上清を廃棄し、H40バッファー内の細胞を再懸濁する。
次に、1~2マイクログラムのDNAを含むチューブに100マイクロリットルの細胞を加えます。ピペットを上下にして、細胞DNA混合物を混合し、冷やしたエレクトロポレーションキュベットに移します。DNAの2マイクログラム以上を追加しないでください。
より高いDNA濃度は細胞にとって有毒であり、効率を低下させる。エレクトロポレーション後、すぐに調製した10センチメートルのペトリ皿に細胞を移し、細胞が5時間回復することを可能にする。ノックアウト、ノックイン、または5つのノックインのためのトランスフェクタントを選択するには、表面上の液体をピペット処理することによってペトリ皿から細胞を取り外します。
次に、テキストプロトコルに従って選択エージェントの3つの希釈液を設定する。最後に、調製した希釈液の150マイクロリットルを96ウェル平底組織培養プレートの各ウェルに分配する。このプロトコルでは、二重レポーターの染色体外プラスミド系が実証された。
トランスフェクションの32時間後、大部分の細胞は両方の蛍光標識融合タンパク質を発現した。5つのMチェリーノックインとNC4も試みた。アガロースゲルで消化を実行した後に2つのバンドが得られた。
4127 基本ペアバンドには、目的の構成が含まれています。精製されたDNAをNC4細胞のトランスフェクションに使用した。NC4トランスフェクションの2つのクローンをPCRを介して分析し、両方とも予測されたバンドパターンを示した。
その後、サザンブロットを使用してPCRの結果を検証しました。NC4は、Ax2細胞よりも細菌の芝生でより速く成長しました。4時間後、NC4細胞の多くはAx2細胞よりもアガロース下を這うことができました。
NC4細胞はより速く、Ax2細胞よりも葉酸に対するより強い化学戦術応答を示した。常に設定したてのSMプレートのセルを使用してください。4日より古い細胞を使用しないでください、そうでなければ効率が低下します。
新鮮に単離された、ノビテニック、白いHAP株は、一般的にジクチオステリウムのフリルまたは社会的行動に関する質問に対処するために使用されます。私たちは、これらの分離株を介して分子遺伝学を適用することができます。
