Il valore di questo protocollo è che consente a quasi tutti i ceppo di dictyostelium discoideum di essere manipolati dalla genetica molecolare, indipendentemente dal fatto che tale ceppo crescerà axenicamente in mezzo liquido o meno. L'altro vantaggio di questa tecnica è che è veloce e semplice. Trasporre per trasfetto le cellule con un plasmide esocromosomiale prima di iniziare a mescolare i dictyosteliums.
I risultati possono già essere convalidati due giorni dopo la trasfezione tramite microscopia. È insolito lavorare con cellule di dictyostelium e sospensione batteriche. La visualizzazione aiuterà a dare agli sperimentatori un'idea di come vengono eseguiti i diversi passaggi dei protocolli.
A dimostrare la procedura con me sarà Soudabeh Imanikia, un postdoc del mio laboratorio. Per iniziare, preparare 1000 millilitri di soluzione di lavoro tampone sorensen con cloruro di magnesio e cloruro di calcio secondo il protocollo di testo. Dopo questo, usa una singola colonia di aerogeni K per inoculare un litro di mezzo LB.
Lascia che i batteri crescano durante la notte a 37 gradi celsius con tremori. Spingi le cellule in due tubi di centrifuga da 500 millilitri per raccogliere le cellule. Quindi, lavare i batteri una volta con 500 millilitri di tampone.
Rimosogliere il pellet in 20 millilitri di tampone. Utilizzare un fotometro per controllare la densità ottica del campione e diluire il campione con tampone fino a quando la densità ottica è di circa 100. Successivamente, preparare il buffer di elettroporazione H40 secondo il protocollo di testo.
Far crescere gli aerogeni K per confluire un mezzo SM durante la notte a temperatura ambiente. Aggiungere 400 microlitri di sospensione batterica a una piastra di agar SM e stenderla uniformemente. Quindi, prendere un ciclo sterile e inocularlo con cellule di dictyostelium e diffondere le cellule su un bordo della piastra.
Incubare la piastra a 22 gradi Celsius per due giorni, per garantire che le zone di crescita siano abbastanza grandi per la trasfezione. Aggiungere 10 millilitri di sospensione aerogena K a una piastra di Petri trattata con coltura di tessuto di 10 centimetri. Quindi, utilizzare un ciclo di inoculazione usa e getta da 10 microliter per raschiare le cellule dalle zone di crescita della piastra di coltura.
Trasferire le cellule in un tubo da 1,5 millilitri, contenente tampone H40 ghiacciato. Ruotare le celle per due secondi a 10000 volte la gravità. Quindi, scartare il supernatante e rimescolare le celle nel buffer H40.
Successivamente, aggiungere 100 microlitri delle cellule a un tubo contenente da uno a due microgrammi di DNA. Pipetta su e giù per mescolare e trasferire la miscela di DNA cellulare in una cuvetta di elettroporazione pre-refrigerata. Non aggiungere più di due microgrammi di DNA.
Una maggiore concentrazione di DNA è tossica per le cellule e riduce l'efficienza. Dopo l'elettroporazione, trasferire immediatamente le cellule in una piastra di Petri preparata di 10 centimetri e lasciare che le cellule si riprendano per cinque ore. Per selezionare un transettore per un knock-out, knock-in o un knock-in atto cinque, staccare le cellule dalla piastra di Petri pipettando il liquido sulla superficie.
Quindi, impostare tre diluizioni dell'agente selettivo in base al protocollo di testo. Infine, distribuire 150 microlitri delle diluizioni preparate in ogni pozzo di piastre di coltura tissutale a fondo piatto da 96 po '. In questo protocollo è stato dimostrato un sistema plasmide extracromosomico dual reporter.
32 ore dopo la trasfezione, la maggior parte delle cellule ha espresso entrambe proteine di fusione etichettate fluorescenti. Un atto cinque M cherry knock-in e un NC4 è stato anche tentato. Due bande sono state ottenute dopo aver eseguono il digest su un gel di agarosio.
La banda della coppia di basi 4127 contiene il costrutto desiderato. Il DNA purificato è stato utilizzato per la trasfezione delle cellule NC4. Due cloni della trasfezione NC4 sono stati analizzati tramite PCR ed entrambi hanno mostrato i modelli di banda previsti.
Southern blot è stato quindi utilizzato per convalidare i risultati della PCR. L'NC4 è cresciuto più velocemente sui prati batterici rispetto alle cellule Ax2. Dopo quattro ore, più cellule NC4 furono in grado di strisciare sotto l'agarosio rispetto alle cellule Ax2.
Le cellule NC4 erano più veloci e mostravano una risposta chemiotattica più forte al folato rispetto alle cellule Ax2. Utilizzare sempre le celle delle piastre SM appena impostate. Non utilizzare mai celle di età superiore ai quattro giorni, altrimenti l'efficienza scenderà.
I ceppi di HAP bianchi appena isolati, non estenici sono comunemente usati per affrontare domande riguardanti un comportamento ruching o sociale dei dictyosteliums. Il nostro permette di applicare la genetica molecolare attraverso quegli isolati.
