La valeur de ce protocole est qu’il permet à presque n’importe quelle souche de dictyostelium discoideum d’être manipulée par la génétique moléculaire, indépendamment du fait que cette souche se développera axenically dans le milieu liquide ou non. L’autre avantage de cette technique est qu’elle est rapide et simple. Transposer aux cellules transfect avec un plasmide exochromosomique avant de commencer à mélanger des dictyosteliums.
Les résultats peuvent déjà être validés deux jours après la transfection à l’aide de la microscopie. Il est inhabituel de travailler avec les cellules de dictyostelium et la suspension des bactéries. La visualisation aidera à donner aux expérimentateurs une idée de la façon dont les différentes étapes des protocoles sont effectuées.
Soudabeh Imanikia, postdoc de mon labo, fera la démonstration de la procédure avec moi. Pour commencer, préparez 1000 millilitres de solution de travail tampon sorensen avec chlorure de magnésium et chlorure de calcium selon le protocole du texte. Après cela, utilisez une seule colonie d’aérogènes K pour inoculer un litre de LB moyen.
Laissez les bactéries se développer toute la nuit à 37 degrés Celsius avec des secousses. Faites tourner les cellules dans deux tubes centrifugeuses de 500 millilitres pour récolter les cellules. Ensuite, lavez les bactéries une fois avec 500 millilitres de tampon.
Resuspendez la pastille en 20 millilitres de tampon. Utilisez un photomètre pour vérifier la densité optique de l’échantillon et diluer l’échantillon avec un tampon jusqu’à ce que la densité optique soit d’environ 100. Après cela, préparez le tampon d’électroporation H40 selon le protocole de texte.
Cultiver des aérogènes K pour confluent un milieu SM pendant la nuit à température ambiante. Ajouter 400 microlitres de suspension bactérienne à une plaque d’agar SM et l’étaler uniformément. Ensuite, prenez une boucle stérile et inoculez-la avec des cellules de dictyostelium et répandez les cellules à un bord de la plaque.
Incuber la plaque à 22 degrés Celsius pendant deux jours, pour s’assurer que les zones de croissance sont assez grandes pour la transfection. Ajouter 10 millilitres de suspension k aérogène à une boîte de Pétri traitée par culture tissulaire de 10 centimètres. Ensuite, utilisez une boucle d’inoculation jetable de 10 microlitres pour gratter les cellules des zones de croissance de la plaque de culture.
Transférer les cellules dans un tube de 1,5 millilitre contenant un tampon H40 glacé. Faites tourner les cellules pendant deux secondes à 10000 fois la gravité. Ensuite, jetez le supernatant et réutilisez les cellules dans le tampon H40.
Ensuite, ajoutez 100 microlitres des cellules à un tube contenant un à deux microgrammes d’ADN. Pipette de haut en bas pour mélanger et transférer le mélange d’ADN cellulaire dans une cuvette d’électroporation pré-refroidie. N’ajoutez pas plus de deux microgrammes d’ADN.
Une concentration d’ADN plus élevée est toxique pour les cellules et réduit l’efficacité. Après électroporation, transférer immédiatement les cellules dans une boîte de Pétri préparée de 10 centimètres et permettre aux cellules de récupérer pendant cinq heures. Pour sélectionner un transfectant pour un knock-out, knock-in, ou un acte cinq knock-in, détachez les cellules de la boîte de Petri en pipetting liquide sur la surface.
Ensuite, mettre en place trois dilutions de l’agent sélectif selon le protocole de texte. Enfin, distribuez 150 microlitres des dilutions préparées dans chaque puits de plaques de culture de tissus à fond plat de 96 puits. Dans ce protocole, un système plasmide extrachromosomal double reporter a été démontré.
32 heures après la transfection, la majorité des cellules ont exprimé les deux protéines fluorescentes de fusion étiquetées. Un acte cinq M cherry knock-in et un NC4 a également été tenté. Deux bandes ont été obtenues après avoir couru le digest sur un gel d’agarose.
La bande de paire de base 4127 contient la construction désirée. L’ADN purifié a été utilisé pour la transfection des cellules NC4. Deux clones de la transfection NC4 ont été analysés via PCR et les deux ont montré les modèles de bande prévus.
La tache sud a ensuite été utilisée pour valider les résultats du PCR. Le NC4 a grandi plus rapidement sur les pelouses bactériennes que les cellules Ax2. Après quatre heures, plus de cellules NC4 ont pu ramper sous l’agarose que les cellules Ax2.
Les cellules NC4 étaient plus rapides et ont montré une réponse chemotactique plus forte à l’acide folique que les cellules Ax2. Utilisez toujours des cellules à partir de plaques SM fraîchement mises en place. N’utilisez jamais de cellules de plus de quatre jours, sinon l’efficacité diminuera.
Des souches hap blanches fraîchement isolées, non extensiques sont couramment utilisées pour répondre aux questions concernant un ruching ou un comportement social des dictyosteliums. Notre permet d’appliquer la génétique moléculaire à travers ces isolats.
