Bu protokolün değeri, bu suş sıvı ortamda eksenli olarak büyüyüp büyümeyeceğine bakılmaksızın, neredeyse her türlü dictyostelium discoideum türünün moleküler genetik tarafından manipüle edilmesine izin verilmesidir. Bu tekniğin bir diğer avantajı hızlı ve basit olmasıdır. Dictyosteliums karıştırmaya başlamadan önce bir ekzoromosomal plazmid ile transfect hücrelere transkt.
Sonuçlar transfeksiyondan iki gün sonra mikroskopi ile doğrulanabilir. Dictyostelium hücreleri ve bakteri süspansiyonu ile çalışmak alışılmadık bir durumdur. Görselleştirme, deneme yapanlara protokollerin farklı adımlarının nasıl gerçekleştirildiği hakkında bir fikir vermenize yardımcı olur.
Prosedürü benimle birlikte göstermek Soudabeh Imanikia, benim laboratuvar bir postdoc olacaktır. Başlamak için, metin protokolüne göre magnezyum klorür ve kalsiyum klorür ile sorensen tampon çalışma çözeltisi 1000 mililitre hazırlamak. Bundan sonra, LB orta bir litre aşılamak için K aerogenes tek bir koloni kullanın.
Bakterilerin sallayarak 37 santigrat derece bir gecede büyümeye izin verin. Hücreleri hasat etmek için iki 500 mililitrelik santrifüj tüpleri aşağı hücreleri spin. Daha sonra bakterileri 500 mililitre tamponla yıkayın.
20 mililitre arabellekte peleti yeniden askıya alın. Numunenin optik yoğunluğunu kontrol etmek için bir fotometre kullanın ve optik yoğunluk yaklaşık 100 olana kadar numuneyi tamponla seyreltin. Bundan sonra, metin protokolüne göre H40 elektroporasyon tamponu hazırlayın.
Oda sıcaklığında bir gecede bir SM orta birleştirmek için K aerogenes grow. Bir SM agar plakasına 400 mikrolitre bakteriyel süspansiyon ekleyin ve eşit olarak yayın. Daha sonra steril bir döngü yütleyin ve dictyostelium hücreleriyle aşılamak ve hücreleri plakanın bir kenarına yayın.
Büyüme bölgelerinin transfeksiyon için yeterince büyük olduğundan emin olmak için plakayı iki gün boyunca 22 derecede kuluçkaya yatırın. 10 santimetrelik doku kültürü yle tedavi edilen Petri kabına 10 mililitre K aerojen süspansiyonu ekleyin. Daha sonra, kültür plakasının büyüme bölgelerinden hücreleri kazımak için 10 mikrolitrelik tek kullanımlık aşılama döngüsü kullanın.
Hücreleri buz gibi H40 tamponu içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri 10000 kat yerçekiminde iki saniye döndürün. Daha sonra, supernatant atın ve H40 tampon hücreleri yeniden askıya.
Daha sonra, 1-2 mikrogram DNA içeren bir tüpe 100 mikrolitre hücre ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı karıştırmak ve önceden soğutulmuş elektroporasyon cuvette hücre DNA karışımı aktarmak için. İki mikrogramdan fazla DNA eklemeyin.
Daha yüksek DNA konsantrasyonu hücreler için toksik ve verimliliği azaltır. Elektroporasyondan sonra, hücreleri hemen hazırlanmış 10 santimetrelik Petri kabına aktarın ve hücrelerin beş saat boyunca iyileşmesini bekleyin. Bir nakavt, knock-in veya bir hareket beş knock-in için bir transfectant seçmek için, yüzey üzerinde sıvı borulama tarafından Petri çanak hücreleri ayırmak.
Daha sonra, metin protokolüne göre seçici aracının üç seyreltme ayarlayın. Son olarak, 96-iyi düz alt doku kültür plakaları her kuyuiçine hazırlanan seyreltme 150 mikrolitre dağıtın. Bu protokolde çift muhabir ekstrakromosomal plazmid sistemi gösterilmiştir.
Transfeksiyondan 32 saat sonra, hücrelerin çoğu hem floresan etiketli füzyon proteinlerini ifade etti. Bir hareket beş M kiraz knock-in ve bir NC4 de denendi. Bir agarose jel üzerinde sindirim çalıştırdıktan sonra iki bant elde edildi.
4127 baz çifti bandı istenilen yapıyı içerir. Saflaştırılmış DNA NC4 hücrelerinin transfeksiyonu için kullanıldı. NC4 transfeksiyonunun iki klonu PCR ile analiz edildi ve her ikisi de öngörülen bant modellerini gösterdi.
Güney leke sonra PCR sonuçlarını doğrulamak için kullanılmıştır. NC4 ax2 hücrelerinden daha bakteriyel çimler üzerinde daha hızlı büyüdü. Dört saat sonra, NC4 hücrelerinin daha Ax2 hücreleri daha agarose altında tarama başardık.
NC4 hücreleri daha hızlıydı ve folata Ax2 hücrelerinden daha güçlü kemotaktik yanıt gösterdi. Her zaman yeni kurulmuş SM plakaları hücreleri kullanın. Dört günden daha eski hücreleri asla kullanmayın, aksi takdirde verimlilik düşer.
Taze izole, nonextenic, beyaz HAP suşları genellikle dictyosteliums bir ruching veya sosyal davranış ile ilgili soruları ele almak için kullanılır. Moleküler genetiği bu izole ler aracılığıyla uygulayabilesin.
