一种研究食细胞诱导免疫应答的 mellonella 口服液模型

我们的协议将G.mellonella的使用从全身感染模型扩展到允许通过自然口服途径进行细菌管理的模型。G.mellonella 是啮齿动物在分析先天微后相互作用的不同特征时合适的替代模型，因为幼虫可用于人类致病细菌。首先将成年飞蛾产的卵子转移到两升箱，里面装着30摄氏度的蜡蛾底板。

一到两周后，当小而微小的幼虫可见时，将25克含有基底的幼虫转移到新鲜的基质中。两周后，根据幼虫的大小，在蜡蛾基质上，将幼虫同步成30至40个幼虫组。两周后，按重量选择幼虫进行实验。

只使用苍白、快速移动的幼虫，质量为180至200毫克。为了强制喂养幼虫，将胰岛素注射器用钝端针头装进口服，每10微升每10微升的幼虫用10至7个细菌。将注射器装入微注射器泵中。

等待幼虫打开口腔部分，然后小心地将注射器插入下部和分娩细菌之间。当所有的幼虫都被喂养后，在37摄氏度的黑暗中孵育动物，在1到24小时之间。对于幼虫加工，用乙醇和喷雾试剂清洁安全罩，以防止 RNase 污染。

在液氮中捕捉冷冻活幼虫。使用迫击炮和虫害以及少量液氮使每个冷冻幼虫均质。当产生粉末均质时，将同质质转移到一次性等待船上，等待液氮蒸发。

当所有幼虫均质化后，将粉状同质质酸盐与一毫升三醇混合在两毫升管中。在室温下孵育混合物一小时。在孵育结束时，通过离心颗粒均质。

将上一液转移到新管中。将上一液与 200 微升 1-Bromo-3-氯丙烷或 BCP 混合。漩涡在室温下孵育5分钟，随后在冰上孵育10分钟。

在第二次孵育结束时，将BCP分离加入反应，将上透明层转移到一个新的两毫升管中。通过混合和反转管5分钟，用500微升异丙醇沉淀转移上层的RNA。然后通过离心收集沉淀RNA。

用 500 微升 75%乙醇清洗沉淀的 RNA 颗粒，并在室温下干燥 RNA 5 至 10 分钟。当乙醇蒸发后，在无核酸酶水中加入100微升核糖酶抑制剂，并小心地旋转管，直到颗粒完全溶解。按标准协议测量RNA质量和数量，确保260比280的比例约为2，260比230的比例在2到2.2之间。

然后根据标准协议使用5微克的分离RNA进行DNase消化和基因表达分析。G.mellonella 能够清除最初输入的细菌负载，直到检测出细菌。随着B.vulgatus和大肠杆菌的16s基因拷贝数在24小时内显著减少。

Commensal施用一种G.mellonella幼虫诱导各种先天免疫标记基因的RNA基因表达。例如，与B.vulgatus施用幼虫相比，LPS识别分子、阿波利波林和血红素在大肠杆菌施用幼虫中表达的一般性要高。此外，与B.vulgatus相比，活性氧和氮的产生在大肠杆菌的喂养下受到强烈调节，以及抗氧化GST基因表达。

此外，在大肠杆菌给法后，差异微生物肽表达的诱导比对B.vulgatus强迫喂养的反应更强烈。请记住只使用健康、白色、快速移动的幼虫，在强制喂养过程中使用耐心，以避免对幼虫造成压力，并包括所有必要的控制措施。G.mellonella免疫标志物的激活可以直接由RUS或GST活性测定确定，ANP的丰度可以通过细菌生长抑制测定确定。

该技术可用作共生菌和致病菌的筛选工具，并可用于探索肠道共生系和病理生物群落，而无需牺牲许多脊椎动物。使用液氮、BCP 或 TREZol 物质时，始终使用适当的个人防护设备。