第三代纳米孔测序是一种功能强大的新型测序技术，能够非常轻松地从各种样品中获取序列信息。该技术的主要优点是测序设备的可移植性、极长的读取长度和数据的实时可用性。纳米孔测序是偏远地区疾病暴发期间一项特别有用的技术。
在西非和中非埃博拉病毒爆发期间和之后，它已成功用于实地实验室。通过纳米孢子测序和用于此目的的 MinION 设备相当容易，在库准备和流细胞加载期间必须小心。要开始此过程，请设置一个接触 PCR，使用热启动高保真DNA聚合酶与适当的反应缓冲液在50微升反应体积与一个微升模板的底塑集放大cDNA。
如果可能，在冰面上或在4摄氏度的冷块中设置反应。如文本协议中所述，在热循环器中孵化反应。在此之后，将50微升PCR产品转移到1.5毫升DNA低结合反应管中。
通过涡流彻底地重新悬浮磁珠。然后将50微升珠子加入PCR反应，混合均好。在室温下在旋转搅拌器上孵育样品 5 分钟，同时以 15 RPM 转速旋转。
简单旋转样品，然后将管子放在磁架上，使磁珠产生颗粒。等到上清液完全澄清后再继续。接下来，吸上一代，而不干扰珠子颗粒并丢弃它。
将70%乙醇的移液器200微升进入反应管，在室温下孵育30秒。在不干扰珠子颗粒的情况下吸制乙醇并丢弃它。再次用乙醇重复这种洗涤过程，总共洗两次。
在室温下空气干燥颗粒一分钟。然后从磁架上拆下反应管。将颗粒重新在30微升无核酸水中，在室温下孵育两分钟。
将反应管放回磁架上，等待反应珠完全颗粒化。在此之后，在不干扰颗粒的情况下去除上经剂，并转移到新的 1.5 毫升反应管。如果要同时对多个样本进行测序，则条形码现在可以通过两个额外的 PCR 步骤添加，然后进行 DNA 清理，如前所述。
首先，在0.2毫升反应管中，将来自每个样品的条形码DNA的条形码量混合在一个45微升的体积中，总共1微克的DNA。对于dA-Tailing，加入7微升的端前反应缓冲液、3个端前酶混合物的微升和5微升的核酸酶自由水。轻轻轻拂管子以混合。
在热循环器中，在20摄氏度下孵育反应5分钟，随后在65摄氏度下孵育5分钟。接下来，对反应产品执行PCR纯化，如文本协议中所述。可选地，使用紫外分光光度计测量样品浓度，服用一微升。
将先前获得的纯化DNA的22.5微升与2.5微升的1D2适配器和25微升的布伦特/TA Ligase主混合组合到一个新的1.5毫升DNA低结合反应管中。轻轻轻拂管子以混合。简单旋转混合物，在室温下孵育10分钟。
然后对反应产品进行PCR纯化，如文本协议中所述。将反应产品的45微升与5微升的条形码适配器混合和50微升的布伦特/TA Ligase主混合在DNA低结合反应管中。轻轻轻拂，在室温下混合和孵育10分钟。
如文本协议所述，净化反应产品，将所得产品储存在冰上或四摄氏度，直到可以使用。首先，在使用前对流单元执行质量检查。为此，请将排序设备连接到主机并打开软件。
将流单元插入测序设备。然后从选择器框中选择流单元格类型，然后单击"可用"以确认。在屏幕底部，单击检查流单元格并选择正确的流单元格类型。
单击"开始测试"以开始质量检查。流细胞至少需要800个活性纳米孔才能使用。首先，通过顺时针方向滑动起注端口盖来打开吸油口盖。
将 P1000 移液器设置为 200 微升，并将尖端插入起用端口。然后将移液器调整为 230 微升，同时将吸液口保持在注口中，以抽出 20 到 30 微升缓冲液并清除任何气泡。在一个新的1.5毫升DNA低结合反应管中，通过将576微升RBF缓冲液与624微升无核酸酶水相结合来准备注油混合物。
小心移液器 800 微升的准备好的注油混合进入注水口，等待五分钟。在此之后，将样品端口盖和移液器再将 200 微升准备好的注油混合物提升到注水口中。移液 35 微升的 RBF 缓冲液放入新的清洁 1.5 毫升 DNA 低结合反应管中。
通过移液彻底混合 LLB 珠子，并将 25.5 微升的珠子添加到 RBF 缓冲液中。接下来，加入2.5微升无核酸酶水和12微升DNA库，通过移液混合。通过样品端口将样品混合物的75微升以缓慢下降的方式加入到流动细胞中。
然后更换样品端口盖，关闭注油端口并合上测序装置的盖子。在软件中，确认流单元仍然可用。打开新实验，通过选择使用的套件来设置运行参数。
选择实时基调用。通过单击"开始实验"开始排序。继续排序运行，直到收集到足够的实验数据。
在一项具有代表性的实验中，从5种动物的10种不同的血液样本中提取RNA。RNA浓度在每微升43纳米和543纳米之间。在RT-PCR放大后，MPC1 PCR产品的凝胶分析显示，对于样品BC01和BC02，其带带明显较弱。
这些差异很可能是由样品质量差异引起的，尽管不能排除由于与不同物种的MCP1基因结合的底木结合差异而引起的PCR功效差异。然而，这些产量和/或扩增效率的差异并没有显著影响整体测序结果。然后选择 10，000 个获得的读取的子集，并进行脱皮，以进行进一步分析。
在分析的10，000次读取中，5，457次显示长度在1，750到2，000个核苷酸之间，与作为工作流程一部分放大的PCR片段的预期大小相匹配。读取长度分布中另一个峰值在 250 到 500 个核苷酸之间，可归因于非特异性 PCR 产品。读取的消除允许将 87.6% 的读取分配给分析的 10 个样本之一。
虽然此方法相当可靠，但在场条件下，PCR 扩增是最有问题的步骤。在我们的经验中，嵌套协议通常是必要的，以放大目标序列。除了对动物宿主基因进行测序外，此方法还可用于测序任何DNA或RNA，包括病毒或细菌病原体。
因此，纳米孔测序现在越来越多地用于疾病爆发或偏远地区的科学研究，而且也越来越多地用于常规实验室，在这些实验室中，长时间的读取为令人振奋的新研究可能性开辟了。虽然使用中没有一种试剂特别危险，但应遵循标准良好的实验室做法。显然，当对疾病制剂进行测序时，必须遵守处理这些制剂的所有必要预防措施。
