O sequenciamento de nanoporos de terceira geração é uma poderosa nova tecnologia de sequenciamento que permite obter facilmente informações de sequência de uma grande variedade de amostras. As principais vantagens desta técnica são a portabilidade do dispositivo de sequenciamento, o comprimento de leitura extremamente longo e a disponibilidade em tempo real dos dados. O sequenciamento de nanoporos é uma tecnologia particularmente útil durante surtos de doenças em locais remotos.
Tem sido usado com sucesso em laboratórios de campo durante e após surtos de vírus ebola na África Ocidental e Central. Via sequenciamento de nanosporos e o uso do dispositivo MinION para este fim é bastante fácil, deve-se tomar cuidado durante a preparação da biblioteca e durante o carregamento da célula de fluxo. Para iniciar este procedimento, configure um PCR de touchdown para amplificar o cDNA com primer set um usando um início quente de polimerase de DNA de alta fidelidade com o buffer de reação apropriado em um volume de reação de 50 microliter com um modelo microliter.
Se possível, configure a reação no gelo ou em um bloco frio a quatro graus Celsius. Incubar a reação em um termociclador conforme descrito no protocolo de texto. Depois disso, transfira 50 microliters do produto PCR para um tubo de reação de baixa ligação de DNA de 1,5 mililitro.
Resuspenda as contas magnéticas completamente por vórtice. Em seguida, adicione 50 microliters de contas à reação pcr e misture bem. Incubar a amostra em uma batedeira rotativa por cinco minutos à temperatura ambiente enquanto gira a 15 RPM.
Gire brevemente a amostra e, em seguida, coloque o tubo em um rack magnético para pelotar as contas magnéticas. Espere até que o supernatante tenha sido completamente esclarecido antes de continuar. Em seguida, aspire o supernatante sem perturbar a pelota de contas e descartá-la.
Pipeta 200 microliters de 70% de etanol no tubo de reação e incubar por 30 segundos em temperatura ambiente. Aspire o etanol sem perturbar a pelota de contas e descarte-o. Repita este processo de lavagem com etanol mais uma vez para um total de duas lavagens.
O ar secou a pelota por um minuto em temperatura ambiente. Em seguida, remova o tubo de reação do rack magnético. Resuspenja a pelota em 30 microlitadores de água livre de nuclease e incubar em temperatura ambiente por dois minutos.
Coloque o tubo de reação de volta no rack magnético e espere até que as contas de reação estejam completamente pelotas. Depois disso, remova o supernatante sem perturbar a pelota e transfira para um novo tubo de reação de 1,5 mililitro. Se várias amostras forem sequenciadas ao mesmo tempo, os códigos de barras agora podem ser adicionados por duas etapas adicionais do PCR seguidas pela limpeza de DNA, como mostrado anteriormente.
Primeiro, combine uma quantidade igual de DNA de código de barras de cada amostra para um total de um micrograma de DNA em um volume de 45 microliters em um tubo de reação de 0,2 mililitro. Para dA-Tailing, adicione sete microliters de tampão de reação de preparação final, três microliters de mistura de enzima de preparação final e cinco microliters de água livre de nuclease. Mova suavemente o tubo para misturar.
Em um termociclador, incubar a reação por cinco minutos a 20 graus Celsius seguido de cinco minutos a 65 graus Celsius. Em seguida, execute a purificação do produto de reação do PCR conforme descrito no protocolo de texto. Opcionalmente, tome um microliter para quantificar a concentração da amostra usando um espectrômetro UV.
Combine 22,5 microliters do DNA purificado anteriormente obtido com 2,5 microliters de adaptador 1D2 e 25 microliters de Blunt/TA Ligase Master Mix em um novo tubo de reação de baixa ligação de DNA de 1,5 mililitro. Mova suavemente o tubo para misturar. Gire brevemente a mistura e incubar em temperatura ambiente por 10 minutos.
Em seguida, execute a purificação do produto de reação do PCR conforme descrito no protocolo de texto. Combine 45 microliters do produto de reação com cinco microliters de mistura de adaptador de código de barras e 50 microliters de Blunt/TA Ligase Master Mix em um tubo de reação de baixa ligação de DNA. Mova suavemente para misturar e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.
Purifique o produto de reação conforme descrito no protocolo de texto e armazene o produto resultante no gelo ou a quatro graus Celsius até estar pronto para usar. Para começar, realize uma verificação de qualidade na célula de fluxo antes de usar. Para isso, conecte o dispositivo de sequenciamento ao computador host e abra o software.
Insira uma célula de fluxo no dispositivo de sequenciamento. Em seguida, escolha o tipo de célula de fluxo da caixa seletora e clique disponível para confirmar. Na parte inferior da tela, clique em verificar a célula de fluxo e escolha o tipo de célula de fluxo correta.
Clique em iniciar o teste para iniciar a verificação de qualidade. Um mínimo de 800 nanoporos ativos no total é necessário para que a célula de fluxo seja utilizável. Primeiro, abra a tampa da porta de escorraça deslizando-a no sentido horário.
Coloque uma pipeta P1000 em 200 microliters e insira a ponta na porta de escoramento. Em seguida, ajuste a pipeta para 230 microliters, mantendo a ponta na porta de escoramento para elaborar 20 a 30 microliters de tampão e remover quaisquer bolhas de ar. Em um novo tubo de reação de baixa ligação de DNA de 1,5 mililitro, prepare a mistura de escoramento combinando 576 microliters de tampão RBF com 624 microliters de água livre nuclease.
Pipeta cuidadosamente 800 microliters da mistura de escoramento preparado na porta de escoramento e espere cinco minutos. Depois disso, levante a tampa da porta da amostra e a pipeta um adicional de 200 microliters da mistura de escoramento preparada para a porta de escoramento. Pipeta 35 microliters do buffer RBF em um novo tubo de reação de baixa ligação de DNA de 1,5 mililitro.
Misture completamente as contas LLB por pipeta e adicione 25,5 microliters das contas ao buffer RBF. Em seguida, adicione 2,5 microliters de água livre de nuclease e 12 microliters de biblioteca de DNA e misture por pipetação. Adicione 75 microliters da mistura de amostra de forma lenta à célula de fluxo através da porta de amostra.
Em seguida, substitua a tampa da porta de amostra, feche a porta de escoramento e feche a tampa do dispositivo de sequenciamento. Dentro do software, confirme se a célula de fluxo ainda está disponível. Abra um novo experimento e configure os parâmetros de execução selecionando o kit usado.
Selecione a chamada de base ao vivo. Inicie a sequência executada clicando no experimento iniciar. Continue a sequência até que dados experimentais suficientes seja coletado.
Em um experimento representativo, o RNA é extraído de 10 amostras de sangue diferentes de cinco espécies animais. Concentrações de RNA são observadas entre 43 nanogramas e 543 nanogramas por microliter. Após a amplificação por RT-PCR, a análise em gel dos produtos MPC1 PCR mostra vários resultados com bandas marcadamente mais fracas para amostras BC01 e BC02.
Essas diferenças são provavelmente causadas por diferenças na qualidade da amostra, embora as diferenças na eficácia do PCR devido a diferenças na vinculação do primer ao gene MCP1 de diferentes espécies não possam ser excluídas. No entanto, essas diferenças de produtividade e/ou eficiência de amplificação não afetam significativamente o resultado geral do sequenciamento. Um subconjunto de 10.000 leituras obtidas é então selecionado e demultiplexado para análise posterior.
Das 10.000 leituras analisadas, 5.457 mostram um comprimento entre 1.750 e 2.000 nucleotídeos que correspondem aos tamanhos esperados para os fragmentos pcr amplificados como parte do nosso fluxo de trabalho. Observa-se um pico adicional na distribuição de extensão das leituras entre 250 e 500 nucleotídeos que podem ser atribuídos a produtos PCR inespecíficos. A desmultiplexação das leituras permite a atribuição de 87,6% das leituras a uma das 10 amostras analisadas.
Embora este método seja bastante confiável, em condições de campo, a amplificação do PCR é o passo mais problemático. Durante nossas experiências, protocolos aninhados eram muitas vezes necessários para amplificar sequências de alvos. Além de sequenciar genes de hospedeiros animais, este método também pode ser usado para sequenciar qualquer DNA ou RNA, incluindo patógenos virais ou bacterianos.
O sequenciamento de nanoporos é, portanto, agora cada vez mais usado não apenas durante surtos de doenças ou para estudos científicos em locais remotos, mas também em laboratórios regulares onde os comprimentos de leitura longa abrem novas possibilidades de pesquisa emocionantes. Embora nenhum dos reagentes usados seja particularmente perigoso, as boas práticas laboratoriais padrão devem ser seguidas. Obviamente, ao sequenciar os agentes da doença, todas as precauções necessárias para o manuseio desses agentes devem ser observadas.
