该协议填补了我们生成超长序列阵列能力的技术空白。它使我们能够检查基因组的复杂性，这受到目前基因组学中短读方法的限制。该方法在性能、鲁棒性、多功能性和与有前途的新应用集成的潜力方面独树一帜。
它适用于不同的材料，可以调制不同的即时尺寸。这项技术已经开始彻底改变临床景观。其诊断效用在重复扩张障碍中克服了许多当前的缺点。
一些移植登记处已经使用高分辨率HLA打字，以更好的临床结果。这些方法提供以前无法获取的远程信息，如相位和复杂的结构方差。再加上表观遗传读出在一个单一的测试，它将使精密医学。
这是一个长协议，有许多新技术，很难知道它的工作，直到最终测序。我建议在运行样品之前练习在旧流单元上加载。合作者说，与短读方法相比，一些技术是令人困惑的。
具体来说，由于高质量、高分子量的DNA，提取更温和。要开始提取HMW DNA，首先在50毫升管中加入200微升细胞悬浮液至10毫升的解液缓冲液中。然后，以最高速度旋转三秒钟。
并在37摄氏度下孵育溶液一小时。在孵育结束时，在酸盐中加入两个RNAS-A微升。轻轻旋转 50 毫升管，将样品混合，在 37 摄氏度下孵育一小时。
孵育后，在碱酸盐中加入10毫升苯酚层苯酚-氯仿-异丙酰醇混合物。在 20 rpm 的转速下将管子放在旋转器上 10 分钟。使用凝胶管离心后，小心地将上经液倒入新的 50 毫升管中。
然后，加入25毫升的冰冷100%乙醇，并用手轻轻旋转管子，直到DNA沉淀。弯曲一个20微升的尖端，使一个挂钩。使用挂钩，小心地拿出HMWDNA，让液体脱落。
然后，将DNA放入含有40毫升70%乙醇的50毫升管中，轻轻反转管三次以清洗DNA。要准备基于机械剪切的库，首先使用100毫升无针注射器来渴望所有的DNA。然后，将一个27量表针放在注射器上，轻轻地缓慢地将所有DNA插入盘中。
重复29次。接下来，在管中加入143微升的再悬浮磁珠和143微升的DNA修复反应混合物。轻拂管六次轻轻混合，以 20 rpm 的转速将管子放在旋转器上 30 分钟。
在室温下以 1000G 离心管两秒钟，以旋转样品，然后将管放在磁性机架上 10 分钟。接下来，当管子仍在机架上时，丢弃上一代。加入400微升新鲜准备好的70%乙醇。
等待 30 秒。然后去除乙醇。然后，在室温下以1000G离心管两秒钟，以旋转样品。
将管子放回磁架上，并去除任何残留乙醇。空气干燥颗粒30秒。接下来，从磁架上拆下管子，并添加 103 微升的 T-E 缓冲液。
然后，轻轻轻拂管子，确保珠子被覆盖在缓冲器中，并在室温下将管子放在旋转器上 30 分钟。最后，将管子放回磁架上 10 分钟，使珠子产生颗粒。使用 P200 宽孔尖端将 100 微升的 Eluate 转移到 0.2 毫升管中，然后进行最终修复 dA 尾和适配器结扎反应。
为了准备基于转置酶的分段库，首先通过添加22微升的HMWDNA、10毫摩尔三酯的微升、pH 8、0.02%Triton X-100和1微升的碎片混合物，在0.2毫微升管中做出DNA标记反应。接下来，使用P200宽孔尖混合反应六次，在30摄氏度孵育1分钟，然后孵育80摄氏度1分钟。保持在四摄氏度。
最后，使用P200宽孔尖端将反应转移到1.5毫升管，并迅速添加1微升的快速适配器混合。使用 P200 宽孔尖端混合反应六次。在室温下孵育反应一小时，然后进行测序。
要开始测序，首先将一个新的流细胞插入纳米孔器件的通道之一。然后，在随附的测序控制软件上，选中流单元的位置框。选择正确的流单元格类型并单击检查流单元格的工作流。
单击"开始测试"按钮以启动流单元质量控制分析。接下来，将 P1000 移液器设置为 100 微升，抽回小于 30 微升的缓冲液以清除流芯中的气泡。添加 30 微升的注油混合，以覆盖起油端口的顶部，以避免引入气泡。
然后，移液器800微升的注油混合进入注油端口，以加载流动单元。当注水混合的注水器还剩下大约 50 微升时，请拿出提示，并在注水端口的顶部添加其余注水混合。接下来，使用 P1000 移液器，将 200 微升的注油混合物添加到流单元中。
然后，在加载之前，使用 P200 移液器设置为 80 微升，在 DNA 库上下移液器六次。最后，通过示例端口将库混合逐滴加载到流单元中，然后进行测序和数据分析。对为机械剪切库构建准备的DNA进行质量控制分析，结果260至280纯度比约为1.9，260至230的纯度约为2.3，显示出良好的DNA样本。
同样的结果也使用DNA即转位分段为基础的库结构。通过脉冲场凝胶电泳对针剪HMW DNA进行尺寸质量控制，结果表明，大部分HMW DNA大于50千基。使用HG00733单元的四次运行结果表明，基于机械剪切库的N50比基于转置碎片的库短。
此外，所有四个运行有超过 2300 读取长度超过 100 千基。与基于机械剪切的库相比，基于转置碎片的库的最大长度更长，制备时间更短。与基于转置碎片的库相比，基于机械剪切的库产生更多的总读取量，表明产量更高。
这两个库都显示出一贯的高质量，超过97%的总碱基与人类参考基因组一致。预期的大小分布显示，所有四个运行的数据比例都超过 50 千基，而基于转置碎片的库的超长读取比例较高。总体目标是保持DNA完好无损，因此避免对DNA进行任何苛刻的处理非常重要。
计算分析是能够最大化方法价值的一个关键因素。我们的团队开发了一种名为 PICKY 的长读分析管道，可以检测具有高灵敏度的全系列 SV。它将为令人兴奋的领域开辟新的途径，如检测复杂的SV和在单个分子水平上进行分阶段排列和修改。
这将大大增进我们对基因组结构的理解。苯酚具有很强腐蚀性。您必须在防烟罩中与个人防护设备一起工作，包括手套、安全眼镜、实验室外套、长裤和鞋子。
