该测定将细菌结构和功能的调制与免疫细胞为基础的抗菌活性相关。因此，在确定改善细菌清除的可能性时，可以评估潜在治疗的关键免疫治疗。蛋白心细胞杀菌分析传统上是评估对细菌产生的有效功能作为异音的金标准。
与现有的高吞吐量标准化检测结果比较，该协议提供了简单性和多功能性。在该协议中，我们研究药物治疗对链球菌肺炎的影响，以及这些影响如何转化为细菌的噬菌体病的改善。在这里，我们应用OPKA到肺炎链球菌细胞。
然而，此协议可以通过评估噬菌体杀死其他病原体的免疫细胞。投入时间优化细菌库存，确保最终的C比值在最佳范围内。我们强烈建议使用流式细胞学，以确保HL60细胞是可行的和活跃的，并尝试不同的培养条件，以确保功能活性细胞。
可视化演示将更好地了解如何镀样以及如何实现可计数样本。首先，准备由500毫升RPMI组成的HL60细胞培养基，辅以L-谷氨酰胺和15毫升热灭活胎儿牛血清。为了殖和维持HL60细胞，在75平方厘米的75平方厘米的75平方厘米的75平方厘米的细胞培养500万细胞，在37摄氏度和5%的二氧化碳中。
为了产生HL60细胞的工作库存，在HL60培养基中每毫升添加大约100万个细胞，并辅以10%二甲基硫化物到一毫升低温管中。为了分化HL60细胞，在HL60细胞培养基的15毫升培养基中培养1.5倍至7个细胞，在OPKA之前的三天内，无菌过滤器中补充0.6%DMF，在75平方厘米的烧瓶中，在37摄氏度和5%的二氧化碳中。要准备细菌库存样本，在37摄氏度下将 WU2 细菌菌株在适当的肉汤中生长约 2 到 4 小时。
接下来，在六千次G下离心，将细菌分粒两分钟，并在适当的汤中将细胞重新在10至30毫升的15%甘油中重新储存。将细菌培养成无菌的1.5毫升离心管，储存在80摄氏度。接下来，在37摄氏度的水浴中解冻一瓶细菌。
在无菌条件下，将细菌细胞取出并重新在500微升OBB中。在30摄氏度下，在血脂板上稀释未经处理的细菌存量，并培养板过夜。孵育步骤后，计算与HL60细胞共同培养的未经处理的细菌群每次稀释的菌落。
记录细菌稀释产生最佳数量的可计数菌落为未来的OPKA与这种细菌库存。解冻一管细菌。在六千次G下培养细菌两分钟，并在上一步获得的最佳稀释时在OBB中重新暂停细胞颗粒。
在圆底 96 井细胞培养板中，每井重新稀释的 10 微升的移液器。然后，将20微升的合适抗体或药物治疗添加到每个实验井重复。对于控制井，根据用于处理井的缓冲液使用 1XPBS 或 OBB。
在室温下以大约 90 rpm 的转速摇动样品板一小时。要收获三天前用DF治疗的HL60分化细胞，在500次G下将细胞分粒3分钟。丢弃上一液，用至少 10 毫升 1XPBS 洗涤颗粒。
在500次G下将洗净的细胞取出三分钟。丢弃上一液，重新暂停OBB中的细胞。以一到五个最终体积加入无菌未稀释的兔子小兔血清。
经过一个小时的细菌培养，将每个样本分成两组重复的井。接下来，将 50 微升的 HL60 补充混合物添加到每组实验井中，仅向细菌井中加入 50 微升 OBB。在 37 摄氏度下摇动 96 井板一小时。
要板样品，用 OBB 在 1 到 5 个最终体积稀释每一个井，使每个样品的体积至少为 50 微升。接下来，将每个样品的移液器50微升直接放到细菌培养板的指定区域，确保样品之间的足够间距。在室温下覆盖样品，让样品干燥约15分钟。
在30摄氏度下一夜之间反转板块和文化。或者，厌氧罐中的培养板，以测试厌氧条件是否影响细菌生长或控制形态。经过隔夜培养后，计算每个指定样本区域中的菌落，然后通过将每个集中的活细胞数与相应的控件进行比较来分析数据。
首次建立这种技术的最困难的方面可能是优化细菌库存的起始C比，以及确保HL60细胞得到有效分化。在启动OPKA之前，使用流式细胞学验证了HL60分化，并采用碘化二甲基作为可行性标记。用DMF治疗三天后，CD35的表达增加，CD71的表达减少。
HL60治疗组中细菌CFO与相应非HL60治疗组相比的平均百分比用于比较不同治疗的细菌细胞存活率。结果表明，通过有效治疗，HL60共培养细胞与无HL60细胞之间的菌落数量不同，表明吞噬效率更高。结果表明，当细菌稀释未得到优化或电镀后未仔细观察菌群生长时，菌落的超生长会妨碍对菌落的准确计数。
尝试此程序时，要记住的最重要的事情是仔细监测细菌孵化，以避免C比过度生长。体内测定可用于在宿主体内进行有效的细菌清除。这些测定可用于确认使用OPKA观察到的免疫功效可译至人类或动物模型。
在以往的重大研究中，蛋白磷杀菌分析已经非常有效，将抗菌疗法与噬菌体免疫反应联系起来。使用细菌病原体可能是危险的。在检测过程中，请时刻佩戴防护个人装备。
