Этот анализ связывает модуляцию бактериальной структуры и функции с антибактериальной активностью на основе иммунных клеток. Таким образом, ключевой иммунотерапевтический потенциал лечения может быть оценен при определении вероятности улучшения бактериального клиренса. Анализ убийства опсонофагоцитов традиционно служит золотым стандартом для оценки эффективных функций антител, поднятых против бактерии, как обсонант.
Этот протокол предлагает простоту и универсальность по отношению к существующим высоким уровнем пропускной способности стандартизированных анализов. В этом протоколе мы исследуем влияние медикаментозного лечения на стрептококковую пневмонию и то, как эти эффекты приводят к улучшению фагоцитоза бактерии. Здесь мы применяем OPKA к клеткам стрептококковой пневмонии.
Однако этот протокол может быть принят для оценки фагоцитического убийства других патогенов иммунными клетками. Посвятите время оптимизации бактериальных запасов и обеспечению того, чтобы окончательные CFUs, которые будут подсчитаны, подпадают под оптимальный диапазон. Мы настоятельно рекомендуем использовать цитометрию потока, чтобы обеспечить HL60 клетки являются жизнеспособными и активными и пытается различные условия культуры для обеспечения функционально активных клеток.
Визуальная демонстрация даст лучшее представление о том, как следует помять образец и как достичь подсчитываемых образцов. Для начала подготовьте средства культуры клеток HL60, состоящие из 500 миллилитров RPMI, дополненных L-глутамином и 15 миллилитров тепловой инактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода. Для распространения и поддержания клеток HL60, культура пять миллионов клеток в 10 миллилитров HL60 клеточной культуры средств массовой информации в 75 квадратных сантиметров вентилируемые колбы при 37 градусов по Цельсию и пять процентов углекислого газа.
Для создания рабочих запасов клеток HL60 добавьте около миллиона клеток на миллилитр в культурных средствах массовой информации HL60, дополненных 10%dimethyl sulfoxide в одну миллилитровую криогенную трубку. Чтобы дифференцировать HL60 клеток, культура 1,5 раза 10 до семи клеток в 15 миллилитров HL60 клеточной культуры средств массовой информации дополняется 0,6% DMF в стерильный фильтр ограничен 75 квадратных сантиметров колбы при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в течение трех дней до OPKA. Для подготовки образцов бактериального запаса, расти WU2 бактериального штамма в соответствующий бульон в течение примерно двух-четырех часов при 37 градусов по Цельсию.
Далее, гранулы бактерий центрифугации в шесть тысяч раз G в течение двух минут и повторного незаменимых клеток в 10 до 30 миллилитров 15%глицерол в соответствующем бульоне. Aliquot культуры бактерий в стерильных 1,5 миллилитров центрифуги труб и хранить при 80 градусов по Цельсию. Далее, оттепель из одного флакона бактериального запаса в 37 градусов по Цельсию водяной бане.
Пеллет бактериальных клеток и resuspend в 500 микролитров OBB в стерильных условиях. Разбавления плиты необработанного бактериального бульона на агарных пластинах крови и культуры пластин на ночь при 30 градусах по Цельсию. После инкубации шаг, рассчитывать колоний для каждого разбавления необработанных бактериальных запасов совместно культурных с HL60 клеток.
Запись, которая разбавления бактерий дает оптимальное количество подсчитывается колоний для будущих OPKAs с этим бактериальным запасом. Оттепель одной трубки бактериального запаса. Пеллетные бактерии при шести тысячах раз G в течение двух минут и повторное использование клеточных гранул в OBB при оптимальном разбавлении, полученном на предыдущем этапе.
Pipette 10 микролитров повторного бактериального разбавления на колодец в круглом дне 96 хорошо пластины культуры клеток. Затем добавьте 20 микролитров соответствующего антитела или медикаментозного лечения к каждому экспериментальному колодец в дублировании. Для контрольных скважин используйте 1XPBS или OBB в зависимости от буфера, используемого для очистных скважин.
Встряхните образец пластины при температуре около 90 об/мин при комнатной температуре в течение одного часа. Для сбора HL60 дифференцированных клеток, которые обрабатываются DMF за три дня до этого, гранулы клеток в 500 раз G в течение трех минут. Откажитесь от супернатанта и вымойте гранулы не менее чем 10 миллилитров 1XPBS.
Пеллет промывают клетки при 500 раз G в течение трех минут. Откажитесь от супернатанта и будем повторно помекать клетки в OBB. Добавить стерильные неразбавленные сыворотки кролика ребенка на один-пять окончательный объем.
После одного часа бактериальной культуры, разделить каждый образец на дубликаты скважин для двух групп. Затем добавьте 50 микролитров смеси HL60 к каждому экспериментальному набору скважин и 50 микролитров OBB только к колодцам бактерий. Встряхните 96 хорошо пластины при 37 градусов по Цельсию в течение одного часа.
Чтобы пластины образцов, разбавить каждый колодец с OBB на один-пять окончательный том, так что каждый образец имеет объем не менее 50 микролитров. Далее, пипетки 50 микролитров каждого образца непосредственно на назначенную область бактериальной пластины культуры, обеспечивая адекватное расстояние между образцами. Накройте крышкой и дайте образцам высохнуть в течение примерно 15 минут при комнатной температуре.
Инвертировать пластины и культуры на ночь при 30 градусов по Цельсию. Кроме того, культуры пластин в анаэробных банках, чтобы проверить, влияют ли аноксические условия на рост бактерий или для контроля для морфологии. После ночной культуры подсчитайте колонии в каждой назначенной области выборки и приступайте к анализу данных, сравнивая количество живых ячеек в каждом наборе с соответствующими элементами управления.
Наиболее сложными аспектами создания этого метода в первый раз, вероятно, будет оптимизация стартовых CFUs бактериального запаса, а также обеспечение HL60 клетки эффективно дифференцированы. Перед запуском OPKA дифференциация HL60 была проверена с использованием цитометрии потока с йодидом пропидия в качестве маркера жизнеспособности. После лечения с DMF в течение трех дней, выражение CD35 было увеличено и выражение CD71 было уменьшено.
Средний процент бактериальных CFUs в HL60 обработанных групп по сравнению с соответствующими не-HL60 обработанных групп был использован для сравнения выживаемости бактериальных клеток различных методов лечения. Результаты показали, что при эффективном лечении, количество колоний были разными между HL60 совместной культуры и не HL60 клеток, что свидетельствует о более эффективном фагоцитозе. Результаты показали, что, когда бактериальное разбавление не было оптимизировано или рост колонии не наблюдался тщательно после покрытия, разрастание колоний могло предотвратить точный подсчет колоний.
Самое главное помнить при попытке этой процедуры является мониторинг бактериальной инкубации тщательно, чтобы избежать разрастания CFUs. In vivo анализы могут быть использованы для ослов эффективного бактериального зазора в принимающей. Эти анализы могут быть использованы для подтверждения иммунной эффективности наблюдается с OPKA являются переводимыми на человека или животных моделей.
Анализ убийства опсонофагоцитов был использован для большого эффекта в предыдущих значительных научных исследованиях, чтобы связать антибактериальную терапию с фагостической иммунной реакцией. Работа с бактериальными патогенами может быть опасной. Пожалуйста, носите защитное личное оборудование в любой момент во время этого анализа.
