Este ensaio liga a modulação da estrutura bacteriana e função à atividade antibacteriana baseada em células imunes. Como tal, um imunoterapêutico chave de um tratamento potencial pode ser avaliado na determinação da probabilidade de melhor liberação bacteriana. O ensaio de morte opsonofofocítico tradicionalmente serve como padrão-ouro para avaliar funções eficazes de anticorpos levantados contra a bactéria como obsonant.
Este protocolo oferece simplicidade e versatilidade sobre os ensaios padronizados de alto rendimento existentes. Neste protocolo, investigamos os efeitos de um tratamento medicamentoso na pneumonia estreptococo e como esses efeitos se traduzem em fagocitose melhorada da bactéria. Aqui, aplicamos o OPKA em células de pneumonia estreptococo.
No entanto, este protocolo pode ser adotado para avaliar a morte fagocítica de outros patógenos por células imunes. Dedique tempo para otimizar os estoques bacterianos e garantir que os CFUs finais a serem contados se enlouqueçam dentro da faixa ideal. Recomendamos fortemente o uso da citometria de fluxo para garantir que as células HL60 sejam viáveis e ativas e tentando diferentes condições culturais para garantir células funcionalmente ativas.
A demonstração visual dará uma melhor compreensão de como a amostra deve ser emplacado e como alcançar amostras contáveis. Para começar, prepare a mídia de cultura celular HL60 composta por 500 mililitros RPMI complementados com L-glutamina e 15 mililitros de soro bovino fetal inativado. Para a propagação e manutenção de células HL60, cultura cinco milhões de células em 10 mililitros de mídia de cultura celular HL60 em frascos de 75 centímetros quadrados ventilados a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono.
Para gerar estoques de trabalho de células HL60, adicione aproximadamente um milhão de células por mililitro na mídia cultural HL60 complementada com sulfóxido de 10% de dimetil em tubos criogênicos mililitros. Para diferenciar as células HL60, a cultura 1,5 vezes 10 para as sete células em 15 mililitros de mídia de cultura celular HL60 complementada com 0,6% DMF em filtro estéril tampado frascos de 75 centímetros quadrados a 37 graus celsius e 5% dióxido de carbono por três dias antes da OPKA. Para preparar as amostras de estoque bacteriano, cresça a cepa bacteriana WU2 em um caldo apropriado por aproximadamente duas a quatro horas a 37 graus celsius.
Em seguida, pelotar as bactérias por centrifugação a seis mil vezes G por dois minutos e resuspensar as células em 10 a 30 mililitros de 15% glicerol no caldo apropriado. Alíquotar da cultura das bactérias em tubos de centrífugas estéreis de 1,5 mililitro e armazenar a 80 graus celsius. Em seguida, descongele um frasco de caldo bacteriano em um banho de água de 37 graus celsius.
Pelota as células bacterianas e resuspend em 500 microlitres de OBB em condições estéreis. Diluições de placas do estoque bacteriano não tratado em placas de ágar de sangue e cultura as placas durante a noite a 30 graus celsius. Após a etapa de incubação, conte as colônias para cada diluição de estoque bacteriano não tratado co-cultivado com células HL60.
Registo qual diluição de bactérias produz o número ideal de colônias contáveis para futuros OPKAs com este estoque bacteriano. Descongele um tubo de estoque bacteriano. Bactérias de pelotas a seis mil vezes G por dois minutos e resuspensam a pelota celular em OBB na diluição ideal obtida na etapa anterior.
Pipeta 10 microliters da diluição bacteriana resuspended por poço em uma placa redonda de cultura de células de fundo 96. Em seguida, adicione 20 microliters de um anticorpo apropriado ou um tratamento medicamentoso a cada poço experimental em duplicata. Para poços de controle, utilize 1XPBS ou OBB dependendo do buffer utilizado para os poços de tratamento.
Agite a placa de amostra a aproximadamente 90 rpm em temperatura ambiente por uma hora. Para colher as células diferenciadas HL60 que são tratadas com DMF três dias antes, pelota as células a 500 vezes G por três minutos. Descarte o supernatante e lave a pelota com pelo menos 10 mililitros de 1XPBS.
Pelota as células lavadas a 500 vezes G por três minutos. Descarte o supernatante e resuspenque as células na OBB. Adicione soro de coelho bebê não diluído estéril em um volume final de um a cinco.
Após uma hora de cultura bacteriana, divida cada amostra em poços duplicados para dois grupos. Em seguida, adicione 50 microliters da mistura complementar HL60 a cada conjunto experimental de poços e 50 microliters de OBB apenas aos poços de bactérias. Agite a placa 96 a 37 graus celsius por uma hora.
Para colher amostras, diluir cada poço com OBB em um volume final de um a cinco para que cada amostra tenha um volume de pelo menos 50 microlitadores. Em seguida, pipeta 50 microliters de cada amostra diretamente em uma área designada de uma placa de cultura bacteriana, garantindo um espaçamento adequado entre as amostras. Cubra e deixe as amostras secarem por aproximadamente 15 minutos à temperatura ambiente.
Inverta as placas e a cultura durante a noite a 30 graus celsius. Alternativamente, placas de cultura em frascos anaeróbicos para testar se as condições anoxicas afetam o crescimento bacteriano ou para controlar a morfologia. Após a cultura da noite para o dia, conte as colônias em cada área amostral designada e prossiga para analisar dados comparando o número de células vivas em cada conjunto com os controles correspondentes.
Os aspectos mais difíceis de estabelecer essa técnica pela primeira vez provavelmente serão otimizar os CFUs iniciais do estoque bacteriano, bem como garantir que as células HL60 sejam efetivamente diferenciadas. Antes de iniciar o OPKA, a diferenciação HL60 foi validada usando citometria de fluxo com iodeto de propídio como marcador de viabilidade. Após ser tratado com DMF por três dias, a expressão de CD35 foi aumentada e a expressão de CD71 foi diminuída.
Os percentuais médios de CFUs bacterianas nos grupos tratados hl60 em comparação com os grupos tratados não-HL60 correspondentes foram utilizados para comparar a sobrevida celular bacteriana de diferentes tratamentos. Os resultados mostraram que, com um tratamento eficaz, o número de colônias foi diferente entre a cocultura HL60 e nenhuma célula HL60, indicativo de fagocitose mais eficiente. Os resultados mostraram que quando a diluição bacteriana não foi otimizada ou o crescimento da colônia não foi cuidadosamente observado após o revestimento, o crescimento excessivo das colônias poderia impedir a contagem precisa das colônias.
A coisa mais importante a ser lembrada ao tentar este procedimento é monitorar cuidadosamente a incubação bacteriana para evitar o crescimento excessivo das UFC. Ensaios in vivo podem ser usados para avaliar o desembaraço bacteriano eficaz dentro de um hospedeiro. Estes ensaios podem ser usados para confirmar que a eficácia imunológica observada com o OPKA é traduzível para modelos humanos ou animais.
O ensaio de morte opsonofocítico tem sido usado para grande efeito em pesquisas significativas anteriores para vincular terapias antibacterianas a respostas imunes fagosticas. Trabalhar com patógenos bacterianos pode ser perigoso. Por favor, use equipamentos pessoais de proteção o tempo todo durante este ensaio.
