מקשה זו מקשרת אפנון של מבנה חיידקים ותפקוד לפעילות אנטיבקטריאלית מבוססת תאים חיסוניים. ככזה, אימונותרפיה מפתח של טיפול פוטנציאלי ניתן להעריך בקביעת הסבירות של שיפור סיווג חיידקי. בדיקת הרג Opsonophagocytic משמשת באופן מסורתי כתקן הזהב להערכת תפקודים יעילים של נוגדנים שהועלו נגד החיידק כאובסוננט.
פרוטוקול זה מציע פשטות ורב-תכליתיות על-פני תפוקה גבוהה קיימת של תפוקה מתוקקנת. בפרוטוקול זה, אנו חוקרים את ההשפעות של טיפול תרופתי על דלקת ריאות סטרפטוקוקוס וכיצד השפעות אלה לתרגם phagocytosis משופרת של החיידק. כאן, אנו מיישמים את OPKA לתאי דלקת ריאות סטרפטוקוקוס.
עם זאת פרוטוקול זה ניתן לאמץ כדי להעריך הרג phagocytic של פתוגנים אחרים על ידי תאים חיסוניים. להקדיש זמן כדי לייעל את מלאי החיידקים ולהבטיח CFUs הסופי להיספר ליפול בתוך הטווח האופטימלי. אנו ממליצים בחום להשתמש בציטומטריית זרימה כדי להבטיח שתאי HL60 יהיה בר קיימא ופעיל ותנסה תנאי תרבות שונים כדי להבטיח תאים פעילים מבחינה תפקודית.
הדגמה חזותית תיתן הבנה טובה יותר של איך המדגם צריך להיות מצופה וכיצד להשיג דגימות לספירה. כדי להתחיל, להכין HL60 תאים תרבות מדיה מורכב 500 מיליליטר RPMI בתוספת L-גלוטמין ו 15 מיליליטר חום סרום לב עוברי מושבת. להפצה ותחזוקה של תאי HL60, תרבות חמישה מיליון תאים ב 10 מיליליטר של מדיה תרבות תא HL60 בבקבוקים 75 ס"מ רבועים אוורור ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני.
כדי ליצור מלאי עבודה של תאי HL60, הוסף כמיליון תאים למיליליטר במדיה התרבותית של HL60 בתוספת 10% דימתיל סולפוקסיד לצינור קריוגני מיליליטר אחד. כדי להבדיל בין תאי HL60, תרבות פי 1.5 10 לשבעת התאים ב-15 מיליליטר של מדיית תרבות תאים HL60 בתוספת 0.6% DMF במסנן סטרילי כתרים 75 בקבוקים רבועים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני במשך שלושה ימים לפני OPKA. כדי להכין את דגימות מלאי החיידקים, לגדל את זן חיידקי WU2 במרק מתאים במשך כשעתיים עד ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, גלולה את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב six,000 פעמים G במשך שתי דקות ו resuspend התאים ב 10 עד 30 מיליליטר של 15% גליצרול במרק המתאים. עליקוט את תרבות החיידקים לתוך סטרילי 1.5 צינורות צנטריפוגה מיליליטר ולאחסן ב 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להפשיר בקבוקון אחד של מלאי חיידקי באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
גלולה את התאים החיידקיים resuspend ב 500 microliters של OBB בתנאים סטריליים. דילול צלחת של מלאי חיידקי מטופל על צלחות אגר דם ותרבות הצלחות לילה ב 30 מעלות צלזיוס. לאחר שלב הדגירה, לספור את המושבות עבור כל דילול של מלאי חיידקי מטופל במשותף עם תאים HL60.
שיא אשר דילול של חיידקים מניב את המספר האופטימלי של מושבות המחוז עבור OPKAs בעתיד עם מלאי חיידקי זה. להפשיר צינור אחד של מלאי חיידקי. חיידקי גלולה בששת אלפים פעמים G במשך שתי דקות ולתלות מחדש את גלולת התא ב OBB בדילול האופטימלי שהושג בשלב הקודם.
פיפטה 10 microliters של דילול חיידקי resuspended ל הבאר בצלחת עגולה למטה 96 תרבות התא. לאחר מכן, להוסיף 20 microliters של נוגדן מתאים או טיפול תרופתי לכל באר ניסיונית כפולה. עבור בארות בקרה, השתמש 1XPBS או OBB בהתאם למאגר המשמש עבור בארות הטיפול.
לנער את צלחת המדגם בכ 90 סל"ד בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. כדי לקצור את HL60 תאים מובחנים המטופלים עם DMF שלושה ימים קודם לכן, גלולה את התאים ב 500 פעמים G במשך שלוש דקות. להשליך את supernatant ולשטוף את גלולה עם לפחות 10 מיליליטר של 1XPBS.
גלולה התאים שטפו ב 500 פעמים G במשך שלוש דקות. השלך את העל-טבעי והתן מחדש את התאים ב- OBB. הוסף סרום ארנב תינוק סטרילי לא מזוהה בנפח של 1 עד 5 הימים.
לאחר שעה אחת של תרבות חיידקית, מחלקים כל דגימה לתוך בארות כפולות עבור שתי קבוצות. לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של תערובת המשלימה HL60 לכל קבוצה ניסיונית של בארות ו-50 מיקרוליטרים של OBB ל הבארות של החיידקים בלבד. לנער את צלחת 96 גם ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
כדי לדגום את הלוח, לדלל כל באר עם OBB בנפח אחד עד חמישה סופיים, כך שלכל מדגם יש נפח של לפחות 50 מיקרוליטרים. לאחר מכן, פיפטה 50 microliters של כל מדגם ישירות על שטח המיועד של צלחת תרבות חיידקית, הבטחת ריווח הולם בין דגימות. מכסים ומאפשרים לדגימות להתייבש במשך כ-15 דקות בטמפרטורת החדר.
להפוך את הצלחות והתרבות לילה ב 30 מעלות צלזיוס. לחלופין, צלחות תרבות בצנצנות אנאירוביות כדי לבדוק אם תנאים אנוקסיים משפיעים על צמיחת החיידקים או לשלוט במורפולוגיה. לאחר תרבות הלילה, ספור את המושבות בכל אזור לדוגמה ייעודי והמשך לניתוח נתונים על-ידי השוואת מספר התאים החיים בכל ערכה לפקדים המתאימים.
ההיבטים הקשים ביותר של הקמת טכניקה זו בפעם הראשונה צפויים להיות אופטימיזציה CFUs ההתחלה של מלאי החיידקים, כמו גם להבטיח את התאים HL60 מובחנים ביעילות. לפני הפעלת OPKA, ההתבראות HL60 אומתה באמצעות ציטומטריית זרימה עם פרופידיום יודיד כסמן כדאיות. לאחר שטופלו ב- DMF במשך שלושה ימים, הביטוי של CD35 הוגדל והביטוי של CD71 ירד.
האחוזים הממוצעים של CFUs חיידקי בקבוצות המטופלות HL60 בהשוואה לקבוצות המטופלות שאינן HL60 המקביל שימשו להשוואת הישרדות התא החיידקי של טיפולים שונים. התוצאות הראו כי עם טיפול יעיל, מספר המושבות היו שונים בין HL60 שיתוף תרבות ללא תאים HL60, המעיד על phagocytosis יעיל יותר. התוצאות הראו כי כאשר דילול החיידקים לא היה אופטימיזציה או צמיחת המושבה לא נצפתה בקפידה לאחר ציפוי, צמיחת יתר של המושבות יכול למנוע ספירה מדויקת של מושבות.
הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא לפקח על הדגירה החיידקית בזהירות, כדי למנוע צמיחת יתר של CFUs. In vivo assays ניתן להשתמש כדי התחת אישור חיידקי יעיל בתוך המארח. ניתן להשתמש בתשקיף זה כדי לאשר את היעילות החיסונית שנצפתה עם OPKA ניתנים לתרגום למודלים של בני אדם או בעלי חיים.
מוצנת ההרג האופוסופגוציטית שימשה להשפעה רבה במחקרים משמעותיים קודמים כדי לקשר טיפולים אנטיבקטריאליים לתגובות חיסוניות פאגוסטיות. עבודה עם פתוגנים חיידקיים יכולה להיות מסוכנת. אנא לבשו ציוד מגן אישי בכל עת במהלך ההתדגם הזה.
