功能金报告系统测量特定分枝杆菌误调速率

蛋白质合成容易出错。然而，错误可能是适应生理压力。我们之前已经表明，分枝杆菌中特定的翻译错误有助于抗生素耐受性。

能够测量特定的误差率使我们能够瞄准这种细菌适应机制。这些技术的主要优点是，在测量质量光谱学不容易检测到的小误差率时，功能增益报告器非常敏感。Nluc/GFP 检测允许进行中等通量筛查，因为它避免了细菌的过度处理和解解。

演示程序将是博士生陈月萌。今天，我们将通过这个视频演示使用这两个记者的程序。首先，接种两毫升7H9介质与野生型和变异分枝杆菌的菌株。

在 37 摄氏度下摇动一至两天，或直到 600 纳米的 OD 达到静止阶段。在 0.5 到 1 左右的 600 纳米处获得 600 纳米的异色和稀释。然后，将 ATC 添加到每毫升 50 毫微克的最终浓度中。

根据手稿立即向培养中添加不同剂量的 ksg，以测量其对误译率的影响。在37摄氏度下孵育，摇晃四到六个小时。接下来，将细菌培养物转移到两毫升管中。

并在室温下以3，220倍g的离心机5分钟分解细菌。离心步骤后，丢弃上流剂，加入40微升1x无源解液缓冲液，破坏细菌。将重新暂停的细菌酸盐转移到白色96井板中，每个样品一井，在室温下摇动20分钟。

在每个井中加入80微升的萤火虫基板。摇动 15 秒钟，用发光计测量亮度。然后，在每井中加入80微升的Renilla基材。

摇动 15 秒钟，然后用亮度计测量亮度。使用校正值计算每个条件的误译率。首先，用细菌处理器菌株接种两毫升7H9培养。

在 37 摄氏度下摇动一至两天，或直到 600 纳米的 OD 达到静止阶段。然后，亚培养在50毫升的7H9介质中生长，直到600纳米的OD达到后期静止阶段。在将细菌分到96井板之前，以每毫升50毫微克的最终浓度加入 ATC，并混合好。

每井添加 100 微升，以一个清晰、圆底的 96 井板。接下来，向选定的油井添加不同剂量的 ksg，以筛选其对误译速率的影响。在板的边缘井中加入200微升无菌水，以限制样品井的蒸发。

在37摄氏度下密封板，摇动并诱导样品16至20小时。使用多通道移液器从每井中钻出 80 微升。将样品传输到黑底 96 井板，然后通过亮度计测量 GFP 信号。

测量 GFP 信号后，以 3，220 次 g 离心板 10 分钟。然后，将50微升的上清液转移到一个白底96井板。然后，将50微升Nluc基材添加到每一个井中。

混合好，用发光计测量发光。最后，通过将校正的Nluc发光值除以GGFP荧光来确定Nluc/GFP比率。在这项工作中，使用Renilla萤火虫记者系统测量在野生类型中存在卡苏加霉素和S.Smegmatis菌株中的误译率，KsgA被删除。

结果表明，ksg降低误译率的剂量依赖方式明显，而在ksgA-删除应变中，ksg的威力较小，由于卡苏加霉素对调制的抗性，误译率的基线较高。使用 Nluc/GFP 记者测量了卡苏加霉素对误译的操作。雷尼拉萤火虫和Nluc/GFP记者都涉及测量荧光素酶活动。

小移液错误可能会导致读数出现动。对于初学者，我们建议增加每个复制的数量，以尽量减少获得不可靠的读数的机会。