结核病分子细菌负荷测定（TB-MBLA）

这个结核病分子细菌分析，回答了三个关键问题。一:病人的疾病负担到底是多少？二:患者疾病负担对抗结核药物的反应如何？

第三:疾病负担与治疗反应之间是什么关系？此检测结果可产生患者结核病负担的定量结果，并测量该负担在短时间内随治疗而变化。通过修改，该方法可应用于其他细菌病原体。

我们已经开发出类似的技术，用于诊断非结核分枝杆菌和与慢性阻塞性肺病有关的细菌。首次执行此技术时，请观看视频并练习步骤。使用患者诊断结果不需要的样本进行练习非常重要。

视觉演示至关重要，因为它简化了学习并掌握步骤，尤其是方法中难以在文本中解释的部分。首先准备单元格区域性。在干净的实验室长椅或一级客舱上，将指数相Bacille Calmette-Guerin 或 BCG 培养的一毫升等分收获到 15 毫升塑料管中，并紧密地合上它们。

在准备患者的痰样时，在通风良好的空间中工作，并遵循 GL One Stop TB 手册中的指南。小心地打开试样杯，将一毫升等分液插入 15 毫升塑料离心管中。然后，紧密关闭管子。

将样品管转移到浸入预热至 95 摄氏度的水浴中的保持架上，确保每个管的 3/4 浸入。将样品煮20分钟。然后，将管子转移到长凳上，在室温下冷却五分钟。

如果使用含有酚氯仿或肿瘤资本乙醇的试剂盒，在烟气罩中进行RNA提取。此处说明的RNA程序是苯酚氯仿提取程序。然而，也可以使用RNA提取的替代方法。

将热灭活样品的一毫升等分转移到1.5毫升管中，并尖峰100微升的萃取控制到每个样品中。关闭管子，通过倒置三次混合。将管子以20，000倍g离心10分钟。

然后，吸升液，留下50微升的沉积物。我们通过移液将950微升的解液缓冲液中的沉淀物悬浮，将整个悬浮液转移到RNA提取试剂盒随附的解合基质管中。紧密合上管子，并确保它们同时贴在盖子和侧面。

然后，在 6，000 rpm 转速下将样品均质 40 秒。在室温下将落酸以12，000倍g离心5分钟。同时，准备新鲜的一毫升管，并添加300微升氯仿。

使用一毫升移液器小心吸气上干液，而不接触落叶基质，并将其与氯仿转移到管中。涡流管五秒钟，让它们沉淀五分钟或直到三个阶段清晰可见。将管子以12，000次g离心5分钟。

然后，小心移液上相，并转移到1.5毫升管。在样品中加入500微升100%乙醇的冰冷乙醇，关闭管子，并反转三次混合。在零下80摄氏度下孵育管子15分钟，或在零下20摄氏度孵育30分钟。

然后，将管子装入预冷却的微型离心机中，并在13，000倍的g和4摄氏度下进行20分钟。丢弃上清液，加入500微升70%冰冷乙醇，再离心机10分钟，达到13000倍。丢弃所有上一液。

并在50摄氏度下孵育管子20分钟，以干燥核酸颗粒，确保管部分打开，使乙醇蒸发。接下来，在颗粒中加入100微升无核水，在室温下孵育5分钟。漩涡样品三秒钟，并继续脱氧核糖核酸去除或储存在零下80摄氏度，直到准备使用。

根据手稿指示和移液器 11 微升准备 DNA 的一个混合物，放入每个含有 RNA 提取物的管中。涡流三秒钟，然后短暂旋转，以去除管壁上的任何液滴。然后，在37摄氏度的高温块或培养箱中孵育管子30分钟。

孵育后，将DNA的一种酶中另外一微升直接加入到管子中，通过涡流混合。然后，在37摄氏度下再孵育管子30分钟。解冻和涡旋DNA的灭活试剂。

然后，在每个RNA提取物中加入10微升。并在室温下孵育管子五分钟。在孵育过程中三次旋转管子。

然后，将混合物以13，000次g离心两分钟，并小心地将上经剂转移到1.5毫升RNA的自由管中，确保不接触任何灭活基质。将所有未知的RNA样本在RNA的自由水中稀释1至10，然后通过涡旋混合5秒钟，然后短暂旋转。解冻MTB和EC-RNA样品，并分别对标准曲线进行7倍和6次稀释。

根据手稿说明准备 RT 加和 RT 减去 PCR 主混音。涡流RT加混合和转移16微升到每个RT加PCR管。然后，涡流RT减去混合，并添加16微升到每个RT减去PCR管。

加入四微升RNA提取物或水，并复制到RT加管。水是非模板控制或 NTC。将四微升RNA提取物或水加入RT减管。

将反应管加载到实时PCR机中，根据手稿中描述的情况对反应进行编程并运行反应。要解释治疗反应，请使用标准曲线将 CQ 值转换为细菌载荷，并计算反应作为治疗后续期间细菌负荷的变化。治疗后细菌负荷的下降表示积极反应，而细菌负荷的变化或上升意味着负反应。

为了验证所有M.tuberculosis杆菌是否热灭活，测量了细胞的光学密度，并与活细胞的光学密度进行比较。热灭活样品未在一段时间中观察到OD变化，表明没有增长。热灭活样品在37摄氏度下孵育，以确定RNA在细胞热灭活后是否降解。

热灭活后立即收获的RNA与BCG培养物和结核阳性痰中一、二、三、四天后分离的RNA无差异。当RNA的 A 酶外源地添加到样品中时，在热灭活之前和之后，所有热灭活样品在四天的孵化过程中发生RNA损失。热灭活对核糖体RNA的影响在BCG培养物和结核阳性患者的痰中测量。

在BCG和痰样中，控制培养的测量细菌负荷高于80摄氏度、85摄氏度和95摄氏度的热灭活培养剂的总载量。样品的热灭活导致RNA损失最小，为下游TB-MBLA和其他下游分子测试留下足够的RNA。传输电子显微镜用于研究细胞是否因热灭活而被水化。

检查低放大率和更高放大率的细胞，可以发现完整的细胞壁和可见的细胞内脂体。细胞看起来拉长了，但没有被杀死。尝试此过程时，请记住添加提取控制，该控制控制可控制因RNA提取不良而导致的任何假阴性结果。

该方法可应用于慢性阻塞性肺病、非结核分枝杆菌感染和其他呼吸道病原体。TB-MBLA的定量结果使患者对结核病治疗的反应的数学和药理建模得以进行。我们期待着在结核病患者管理的日常护理中应用这项技术。