小鼠胰腺胰岛细胞亚群中的钙动力学成像

该协议允许兰格汉斯胰岛内细胞小亚细胞的快速分离功能。该技术的优点包括获取数据的实时性和高统计能力，因此具有很高的可重复性。要固定小岛进行成像，请为倒置显微镜组装成像室，并在室内放置玻璃盖滑。

确保玻璃室界面防水，并确认盖滑在显微镜目标的范围内。接下来，切割20个20毫米方的细而粗网格，并使用45至50微米的厚胶带在一块细网上创建两个隔开墙。将粗网和重量浸入35毫米的培养皿中，将细网置于解剖显微镜下。

将细网与空间墙倒置，隔开器朝上。并使用 p20 移液器在两个分空间之间传输多个小岛。使用制表师的钳子，将网格倒置在倒置显微镜的成像室内，使空间器朝下直接位于室盖滑上，将空间和网格之间的小岛困在盖滑的中间。

注意网格水分充足，不含有过多的溶液，从而引发样品的横向运动。然后将粗网格和重量放在腔室中细网格的顶部，并将成像溶液添加到腔室中。一旦小岛固定，选择倒置显微镜上的成像模式和目标，将带小孔的腔室置于显微镜的温度控制阶段。

设置灌注后，将流入位置低于腔室内的流出，并设置流出通量大于流入流量。确保流出与溶液的接触最小，从而在多个连续的小液滴中去除溶液，避免连续去除溶液的长时间间隔。接下来，使用含有三毫摩尔葡萄糖的成像溶液开始灌注，并选择光路和滤光片进行成像绿色荧光。

然后运行实时成像以设置成像参数并调整视图以捕获感兴趣的小岛。要优化图像的声噪比，请调整激发光强度、曝光时间和装箱，确保设置允许以尽可能低的光强和曝光度对小岛内的每个细胞进行独特的可视化。然后以 0.1 到 5 赫兹对小岛进行图像，在捕获时检查获取数据的质量。

当α细胞活性可检测到时，尽可能使用采集软件中信号动力学的在线图表，并将肾上腺素或谷氨酸加入沐浴溶液两到五分钟。将观察到钙的快速跳跃，然后减缓或取消α细胞振荡。接下来，添加 ghrelin，最近报告有选择性地激活三角洲细胞。

钙的可逆性快速增加将在小的小细胞亚细胞中观察到。然后加入10毫摩尔葡萄糖。将观察到β细胞亚细胞亚细胞的协同振荡反应。

另请注意以前被肾上腺素或谷氨酸和格列林激活的细胞的反应。保存图像后，将数据导入相应的数据分析软件程序，并使原始荧光强度数据与荧光的初始值标准化。如果细胞到细胞变异荧光强度数据集仍然很大，则为应用控制溶液的时间范围定义一个控制区域。

如果控制区域具有清晰的非振荡信号，则假定每次应用控制溶液后，荧光强度将返回到基线。要更正每个单元格的时间推移数据，请将数据拆分为由添加控制解的点分隔的段，并应用于每个段的线性校正。如果控制范围具有明显的振荡或存在其他因素，请使用尖峰检测算法。

要测量钙尖峰的频率和对添加激动剂和拮抗剂的反应，请将记录拆分为相等的时间间隔，计算间隔内的峰值，并规范化到间隔持续时间以计算部分频率的时间过程。或者，设置阈值并计算每个间隔的高原分数。分数指示单元格在兴奋状态下所花费的时间间隔内的时间百分比。

或计算每个间隔的曲线下的部分区域。除非膜的脂质成分受到影响，否则小岛与热带染料的负荷相当好。人类腺病毒5型载体也成功地瞄准了小岛细胞。

在低血糖水平下很容易检测到α细胞中的钙尖峰，低血糖下的活动与肾上腺素和谷氨酸的反应之间具有很高的细胞相关性。Ghrelin 在低血糖下激活一些肾上腺素反应细胞，但对低血糖激活的大多数细胞中的钙动力学没有影响。当从部分频率分析，肾上腺素或格林刺激细胞显示显著增加的情况下，全或全无条件下，虽然基础尖峰和肾上腺素效应之间的整体变化是微妙的。

相比之下，曲线下的部分区域对肾上腺素在所有细胞中引入的变化敏感，即使基底活性高。确保所有网格都与成像解决方案接触，并注意合理密集地定位组织以避免气泡。该方法可以扩展为包括人工智能，用于区分细胞类型。

药理标记可以由模式识别技术取代，从而减少记录时间。