הפרוטוקול מאפשר תפקוד מבודד מהיר של תת-כפילויות קטנות של תאים בתוך איי הלבלב של לנגרהנס. היתרונות של טכניקה זו כוללים את הטבע בזמן אמת ואת הכוח הסטטיסטי הגבוה, ומכאן רבייה גבוהה, של הנתונים שנרכשו. כדי לשתק את האיים להדמיה, להרכיב תא הדמיה עבור מיקרוסקופ הפוך ולהמקם כיסוי זכוכית להחליק בתוך התא.
ודא כי ממשק תא הזכוכית הוא אטום למים ולאשר כי להחליק את הכיסוי הוא בהישג יד של המטרה מיקרוסקופ. לאחר מכן, לחתוך 20 על ידי 20 ריבועים מילימטר של רשת עדין וגס ולהשתמש 45 עד 50 חתיכות מיקרומטר של סרט דביק עבה כדי ליצור שני קירות רווח על פיסת רשת עדין. לטבול את רשת גסה ומשקל בצלחת פטרי 35 מילימטר של פתרון הדמיה, ולה מניחים את רשת בסדר תחת מיקרוסקופ ניתוח.
סובבו את רשת שינוי עדין עם קירות הרווח במהופך והמרחבים הפונים כלפי מעלה. ולהשתמש פיפטה p20 להעביר כמה איונים בין שני רווחים. באמצעות מלכודות של שענים, מניחים את רשת המים במהופך בתוך תא ההדמיה של המיקרוסקופ ההפוך, כך שהמשטחים פונים כלפי מטה כדי לשבת ישירות על החלקת כיסוי התא, לוכדים את איונים בין הרווחים ואת רשת באמצע החלקת הכיסוי.
יש לדאוג כי רשת הוא hydrated היטב מבלי להכיל כמויות מוגזמות של פתרון אשר יעורר את התנועה ההפוכות של המדגם. לאחר מכן מניחים את רשת גסה ואת המשקל על גבי רשת בסדר בתא, ולהוסיף פתרון הדמיה לתא. לאחר שהאיונים משותקים, בחרו את מצב ההדמיה והמטרה במיקרוסקופ ההפוך והנחו את התא עם האיים על השלב מבוקר הטמפרטורה של המיקרוסקופ.
לאחר הגדרת הזלוש, מקם את הזרימה נמוכה יותר מהזרימה בתוך התא והגדר את שטף הזרימה להיות גדול יותר שטף הזרימה. ודא כי הזרימה יש מגע מינימלי עם הפתרון, כך שהוא מסיר את הפתרון טיפות קטנות רציפות מרובות, הימנעות מרווחי זמן ארוכים של הסרת פתרון מתמשך. לאחר מכן, ליזום את חיסון עם פתרון הדמיה המכיל גלוקוז שלושה מילימולרים, ולבחור את נתיב האור ומסננים להדמיה פלואורופורים ירוקים.
לאחר מכן הפעל הדמיה חיה כדי להגדיר את פרמטרי ההדמיה ולהתאים את התצוגה כדי ללכוד את איונים מעניינים. כדי למטב את יחס האות לרעש של התמונה, התאימו את עוצמת אור העירור, את זמן החשיפה ואת התאור, כדי להבטיח שההגדרות יאפשרו הדמיה ברורה של כל תא בתוך האיים בעוצמת האור המינימלית האפשרית ובחשיפה. לאחר מכן תמונה האיים ב 0.1 עד 5 הרץ, בדיקת איכות הנתונים שנרכשו כפי שהוא נתפס.
כאשר ניתן לזהות את פעילות תא האלפא, השתמש בתרשים מקוון של דינמיקת האות בתוכנת הרכישה והוסף אדרנלין או גלוטמט לתסמת האמבטיה למשך שתיים עד חמש דקות. קפיצה מהירה בסידן ואחריו האטה או ביטול של תנודות תא אלפא יבחינו. לאחר מכן, להוסיף ghrelin, אשר דווח לאחרונה כדי להפעיל תאי דלתא באופן סלקטיבי.
עלייה מהירה והפיכה בסידן תישמר בתת-תפוקה קטנה של תאי איון. לאחר מכן מוסיפים 10 מילימולר גלוקוז. תגובה מתנדת מתואמת בתת-התת-תפורת של תא הבטא תישמר.
שימו לב גם לתגובות של תאים שהופעלו בעבר על ידי אדרנלין או גלוטמט וגרלין. לאחר שמירת התמונות, יבא את הנתונים לתוכנה מתאימה לניתוח נתונים ונרמל את נתוני עוצמת הפלואורסצנטיות הגולמית לערך הראשוני של פלואורסצנטיות. אם ערכת הנתונים של עוצמת הפלואורסצנטיות של התא לתא עדיין משמעותית, הגדר אזור בקרה עבור טווח הזמן שבמהלכו הוחל פתרון הבקרה.
אם לאזור הבקרה יש אות ברור שאינו מתנד, הנח שעוצמת הפלואורסצנטיות חזרה לקו הבסיס לאחר כל יישום של פתרון הבקרה. כדי לתקן את נתוני איבוד הזמן עבור כל תא, פצל את הנתונים למקטעים המופרדים באמצעות הנקודות שבהן נוסף פתרון הבקרה והחל תיקון ליניארי על כל מקטע. אם טווח הבקרה כולל תנודות ברורות או שיש גורמים נוספים, השתמש באלגוריתם לזיהוי ספייק.
כדי למדוד את התדירות של קוצים סידן ואת התגובה לתוספת של אגוניסטים ואנטגוניסטים, לפצל את ההקלטה למרווחי זמן שווים, לספור את הקוצים בתוך המרווח, ולנרמל את משך הזמן כדי לחשב את מסלול הזמן של התדר החלקי. לחלופין, הגדר את הסף ו לחשב את שבר הרמה עבור כל אחד מהמרווחים. השבר מציין את אחוז הזמן בתוך מרווח הזמן שהתא בילה במצב הנרגש.
לחלופין, מחשב את האזור החלקי מתחת לעקומה עבור כל אחד מהמרווחים. אלא אם כן הרכב השומנים של הממברנה הושפע, איונים לטעון די טוב עם צבעים טרופיים. אדנווירוס אנושי מסוג 5 וקטור גם בהצלחה מטרות תאי איון.
ניתן לזהות בקלות ספיגת סידן בתאי אלפא ברמות גלוקוז נמוכות, ויש מתאם גבוה בין הפעילות בגלוקוז נמוך לבין התגובה לאדרנלין וגלוטמט. Ghrelin מפעיל כמה תאים מגיבים אדרנלין בגלוקוז נמוך אבל אין השפעה על דינמיקת הסידן ברוב התאים המופעלים על ידי גלוקוז נמוך. כאשר מנתחים במונחים של תדירות חלקית, אדרנלין או תאים מגורה גרלין להציג עלייה משמעותית תחת תנאי הכל או כלום, אם כי השינויים הכוללים בין spiking בסיס אפקט האדרנלין הם עדינים.
לעומת זאת, האזור החלקי מתחת לעקומה רגיש לשינויים שהנהגנה האדרנלין בכל התאים גם כאשר הפעילות הבסיסית גבוהה. ודא שכל רשתות שינוי נמצאים במגע עם פתרון הדמיה ולדאוג למקם את הרקמה בצפיפות סבירה, כדי למנוע בועות אוויר. ניתן להרחיב את השיטה כך שתכלול את הבינה המלאכותית להבחנה בין סוגי התאים.
ניתן להחליף את סמנים תרופתיים על ידי טכנולוגיית זיהוי דפוס, ובכך לצמצם את זמן ההקלטה.
