Il protocollo consente una rapida funzione isolata di piccole sottopopolazioni di cellule all'interno di isolotti pancreatici di Langerhans. I vantaggi di questa tecnica includono la natura in tempo reale e l'elevato potere statistico, e quindi l'elevata riproducibilità, dei dati acquisiti. Per immobilizzare gli isolotti per l'imaging, assemblare una camera di imaging per un microscopio invertito e posizionare un coperchio di vetro all'interno della camera.
Assicurarsi che l'interfaccia della camera di vetro sia a tenuta stagna e confermare che lo slittamento del coperchio è alla portata dell'obiettivo del microscopio. Successivamente, tagliare 20 per 20 millimetri quadrati di rete fine e grossolana e utilizzare pezzi da 45 a 50 micrometri di nastro adesivo spesso per creare due pareti distanziale su un pezzo di rete fine. Immergere la rete grossolana e un peso in una piastra di Petri da 35 millimetri di soluzione di imaging e posizionare la rete fine sotto un microscopio sezionante.
Ruotare la rete fine con le pareti del distanziale capovolte e i distanziati rivolti verso l'alto. E utilizzare una pipetta p20 per trasferire diversi isolotti tra i due distanziali. Utilizzando le forcep degli orologiai, posizionare la rete capovolta all'interno della camera di imaging del microscopio rovesciato in modo che i distanziali si guardino verso il basso per sedersi direttamente sullo scivolo del coperchio della camera, intrappolando gli isolotti tra i distanziali e la rete al centro dello scivolo di copertura.
Fare attenzione che la rete sia ben idratata senza contenere volumi eccessivi di soluzione che provocherebbero il movimento laterale del campione. Quindi posizionare la rete grossolana e il peso sopra la rete fine nella camera e aggiungere la soluzione di imaging alla camera. Una volta immobilizzati gli isolotti, selezionare la modalità di imaging e l'obiettivo sul microscopio invertito e posizionare la camera con gli isolotti sullo stadio di temperatura controllata del microscopio.
Dopo aver impostato la perfusione, posizionare l'afflusso inferiore al deflusso all'interno della camera e impostare il flusso di deflusso su maggiore del flusso di afflusso. Assicurarsi che il deflusso abbia un contatto minimo con la soluzione in modo da rimuovere la soluzione in più piccole goccioline sequenziali, evitando lunghi intervalli di rimozione continua della soluzione. Quindi, avviare la perfusione con soluzione di imaging contenente tre millimolari di glucosio e selezionare il percorso della luce e i filtri per l'imaging di fluorofori verdi.
Quindi eseguire l'imaging dal vivo per impostare i parametri di imaging e regolare la vista per acquisire gli isolotti di interesse. Per ottimizzare il rapporto segnale-rumore dell'immagine, regolare l'intensità della luce di eccitazione, il tempo di esposizione e il binning, assicurando che le impostazioni consentano una visualizzazione distinta di ogni cella all'interno degli isolotti alla minima intensità luminosa ed esposizione possibile. Quindi immagini gli isolotti da 0,1 a cinque hertz, controllando la qualità dei dati acquisiti man mano che vengono acquisiti.
Quando l'attività delle cellule alfa è rilevabile, utilizzare un grafico online della dinamica del segnale all'interno del software di acquisizione il più possibile e aggiungere adrenalina o glutammato nella soluzione da bagno per due o cinque minuti. Si osserverà un rapido salto nel calcio seguito da un rallentamento o cancellazione delle oscillazioni delle cellule alfa. Quindi, aggiungi la grelina, che è stata recentemente segnalata per attivare le cellule delta in modo selettivo.
Un rapido aumento reversibile del calcio sarà osservato in una piccola sottopopolazione di cellule isolotti. Quindi aggiungere 10 millimolare di glucosio. Si osserverà una risposta oscillatoria coordinata nella sottopopolazione delle cellule beta.
Si notano anche le risposte delle cellule precedentemente attivate da adrenalina o glutammato e grelina. Dopo aver salvato le immagini, importare i dati in un programma software di analisi dei dati appropriato e normalizzare i dati di intensità della fluorescenza grezza al valore iniziale della fluorescenza. Se il set di dati sull'intensità della fluorescenza da cella a cella è ancora sostanziale, definire un'area di controllo per l'intervallo di tempo durante il quale è stata applicata la soluzione di controllo.
Se la regione di controllo ha un segnale chiaro non oscillatorio, si supponga che l'intensità della fluorescenza sia tornata alla linea di base dopo ogni applicazione della soluzione di controllo. Per correggere i dati time lapse per ogni cella, dividere i dati in segmenti separati dai punti in cui è stata aggiunta la soluzione di controllo e applicare la correzione lineare a ciascun segmento. Se l'intervallo di controllo presenta oscillazioni chiare o sono presenti fattori aggiuntivi, utilizzare un algoritmo di rilevamento dei picchi.
Per misurare la frequenza dei picchi di calcio e la risposta all'aggiunta di agonisti e antagonisti, dividere la registrazione in intervalli di tempo uguali, contare i picchi all'interno dell'intervallo e normalizzare alla durata dell'intervallo per calcolare il corso temporale della frequenza parziale. In alternativa, impostate la soglia e calcolate la frazione di plateau per ciascuno degli intervalli. La frazione indica la percentuale di tempo all'interno dell'intervallo trascorso dalla cella nello stato eccitato.
Oppure calcola l'area parziale sotto la curva per ciascuno degli intervalli. A meno che la composizione lipidica della membrana non sia stata influenzata, gli isolotti si caricano abbastanza bene con coloranti tropicali. Il vettore umano adenovirus di tipo 5 prende di mira con successo anche le cellule isolotto.
Lo spiking del calcio nelle cellule alfa può essere facilmente rilevato a bassi livelli di glucosio e c'è un'alta correlazione cellula per cellula tra l'attività a basso glucosio e la risposta all'adrenalina e al glutammato. La grelina attiva alcune cellule adrenaliniche reattive a basso glucosio ma non ha alcun effetto sulla dinamica del calcio nella maggior parte delle cellule che vengono attivate da basso glucosio. Se analizzate in termini di frequenza parziale, le cellule adrenaliniche o stimolate da grelina mostrano un aumento sostanziale nelle condizioni tutto o niente, anche se i cambiamenti complessivi tra lo spiking basale e l'effetto adrenalina sono sottili.
Al contrario, l'area parziale sotto la curva è sensibile ai cambiamenti introdotti dall'adrenalina in tutte le cellule anche quando l'attività basale è alta. Assicurarsi che tutte le maglie siano a contatto con la soluzione di imaging e fare attenzione a posizionare il tessuto in modo ragionevolmente denso per evitare bolle d'aria. Il metodo può essere espanso per includere l'intelligenza artificiale per differenziare tra i tipi di cellule.
I marcatori farmacologici possono essere sostituiti dalla tecnologia di riconoscimento del modello, riducendo così il tempo di registrazione.
