O protocolo permite uma rápida função isolada de pequenas subpopulações de células dentro de ilhotas pancreáticas de Langerhans. As vantagens dessa técnica incluem a natureza em tempo real e o alto poder estatístico e, portanto, alta reprodutibilidade, dos dados adquiridos. Para imobilizar as ilhotas para imagem, monte uma câmara de imagem para um microscópio invertido e coloque uma tampa de vidro dentro da câmara.
Certifique-se de que a interface da câmara de vidro é impermeável e confirme que o deslizamento da tampa está ao alcance do objetivo do microscópio. Em seguida, corte 20 por 20 milímetros quadrados de malha fina e grossa e use peças de 45 a 50 micrômetros de fita adesiva grossa para criar duas paredes espaçadoras em um pedaço de malha fina. Mergulhe a malha grosseira e um peso em uma placa de Petri de 35 milímetros de solução de imagem, e coloque a malha fina sob um microscópio dissecando.
Vire a malha fina com as paredes espaçadoras de cabeça para baixo e os espaçadores voltados para cima. E use uma pipeta p20 para transferir várias ilhotas entre os dois espaçadores. Usando as fórcecas dos relojoeiros, coloque a malha de cabeça para baixo dentro da câmara de imagem do microscópio invertido para que os espaçadores fiquem voltados para baixo para se sentar diretamente no deslizamento da tampa da câmara, prendendo as ilhotas entre os espaçadores e a malha no meio do deslizamento da tampa.
Tome cuidado para que a malha esteja bem hidratada sem conter volumes excessivos de solução que provocariam o movimento lateral da amostra. Em seguida, coloque a malha grosseira e o peso em cima da malha fina na câmara, e adicione a solução de imagem à câmara. Uma vez que as ilhotas tenham sido imobilizadas, selecione o modo de imagem e o objetivo no microscópio invertido e coloque a câmara com as ilhotas no estágio controlado pela temperatura do microscópio.
Após definir a perfusão, posicione a entrada menor do que a saída dentro da câmara e defina o fluxo de saída para ser maior do que o fluxo de entrada. Certifique-se de que o fluxo de saída tenha um contato mínimo com a solução para que ela remova a solução em múltiplas gotículas pequenas sequenciais, evitando longos intervalos de remoção contínua da solução. Em seguida, inicie a perfusão com solução de imagem contendo três glicemia milimilas, e selecione o caminho de luz e filtros para imagem de fluoroforos verdes.
Em seguida, execute imagens ao vivo para configurar os parâmetros de imagem e ajustar a exibição para capturar as ilhotas de interesse. Para otimizar a relação sinal-ruído da imagem, ajuste a intensidade da luz de excitação, o tempo de exposição e o binning, garantindo que as configurações permitam uma visualização distinta de cada célula dentro das ilhotas na mínima intensidade e exposição da luz possível. Em seguida, imagem as ilhotas em 0,1 a cinco hertz, verificando a qualidade dos dados adquiridos como ele é capturado.
Quando a atividade da célula alfa for detectável, use um gráfico on-line da dinâmica do sinal dentro do software de aquisição possível e adicione adrenalina ou glutamato na solução de banho por dois a cinco minutos. Um rápido salto no cálcio seguido de uma desaceleração ou cancelamento das oscilações das células alfa será observado. Em seguida, adicione ghrelin, que foi recentemente relatado para ativar células delta seletivamente.
Um rápido aumento reversível no cálcio será observado em uma pequena subpopulação de células ilhotas. Em seguida, adicione 10 milimões de glicose. Uma resposta oscilatória coordenada na subpopulação de células beta será observada.
Observe também as respostas das células que foram previamente ativadas por adrenalina ou glutamato e grelina. Após salvar as imagens, importe os dados em um programa de software de análise de dados apropriado e normalize os dados de intensidade de fluorescência bruta para o valor inicial da fluorescência. Se o conjunto de dados de intensidade de fluorescência de variabilidade celular para célula ainda for substancial, defina uma região de controle para o intervalo de tempo durante o qual a solução de controle foi aplicada.
Se a região de controle tiver um sinal não oscilatório claro, assuma que a intensidade da fluorescência retornou à linha de base após cada aplicação da solução de controle. Para corrigir os dados de lapso de tempo para cada célula, divida os dados em segmentos separados pelos pontos em que a solução de controle foi adicionada e aplique correção linear a cada segmento. Se o intervalo de controle tiver oscilações claras ou fatores adicionais estiverem presentes, use um algoritmo de detecção de picos.
Para medir a frequência de picos de cálcio e a resposta à adição de agonistas e antagonistas, dividir a gravação em intervalos de tempo iguais, contar os picos dentro do intervalo e normalizar a duração do intervalo para calcular o curso de tempo da frequência parcial. Alternativamente, defina o limiar e calcule a fração do planalto para cada um dos intervalos. A fração indica a porcentagem de tempo dentro do intervalo que a célula passou no estado animado.
Ou calcular a área parcial sob a curva para cada um dos intervalos. A menos que a composição lipídica da membrana tenha sido afetada, as ilhotas carregam muito bem com corantes tropicais. O vetor humano do tipo 5 também tem como alvo com sucesso células ilhotas.
O espetamento de cálcio em células alfa pode ser facilmente detectado em baixos níveis de glicose, e há uma alta correlação celular por célula entre a atividade em baixa glicose e a resposta à adrenalina e glutamato. A grelina ativa algumas células responsivas de adrenalina com baixa glicose, mas não tem efeito na dinâmica do cálcio na maioria das células que são ativadas pela baixa glicose. Quando analisadas em termos de frequência parcial, a adrenalina ou as células estimuladas por grelina apresentam um aumento substancial sob as condições de tudo ou nada, embora as mudanças gerais entre o espigão basal e o efeito adrenalina sejam sutis.
Em contraste, a área parcial sob a curva é sensível às mudanças introduzidas pela adrenalina em todas as células, mesmo quando a atividade basal é alta. Certifique-se de que todas as malhas estejam em contato com a solução de imagem e tome cuidado para posicionar o tecido razoavelmente densamente para evitar bolhas de ar. O método pode ser expandido para incluir a inteligência artificial para diferenciar entre os tipos de células.
Os marcadores farmacológicos podem ser substituídos pela tecnologia de reconhecimento de padrões, reduzindo assim o tempo de gravação.
