该协议为研究CD4T细胞响应提供了一个平台，这些反应通常很弱，难以检测。此技术允许在不事先了解抗原表示的情况下检测、枚举和隔离 CD4T 细胞。主要优点是分析CD4T细胞，这些细胞通常是与自身免疫性疾病（如1型糖尿病）相关的罕见人群。
从健康献血者那里获得外周血样本后，至少以一至两个比例稀释PBS中的血液，然后将35毫升的血液分层到15毫升密度梯度介质中。按密度梯度离心分离细胞，并去除产生的顶部血浆层约20毫升。然后收集白细胞层小心，以避免红细胞颗粒和洗细胞三次新鲜PBS。
计数后，将细胞稀释至每毫升PBS浓度的1倍至第六位外周血单核细胞或PBMC。将每个对照的300微升细胞加入到单独的10毫升管中。用PBS给每个管浇注后，通过离心沉淀细胞，以每毫升RP5中浓度的10倍至第六细胞重新悬浮细胞。
然后板100微升细胞每个控制到三个井的96孔板包含100微升RP5介质每孔。将盘子放在细胞培养箱中七天。接下来，将剩余的 PBMC 转移到新的 50 毫升管中，并在管侧添加一微升 CFSE 工作库存溶液。
快速反转管几次混合，将细胞放在细胞培养箱中五分钟。在孵育结束时，用5毫升RP5介质进行反应，通过离心收集细胞。每毫升新鲜RP5介质中，每毫升将颗粒以1倍10至第六PBMC重新暂停，并将一毫升细胞加入每根10毫升的管中进行测试。
然后，在含有100微升RP5介质的96孔板井的三口井中，每口每口添加100微升的抗原，并辅以每口井的稀释抗原。将盘子放在细胞培养箱中七天。为了染色CD4+T细胞群进行流动细胞测量分析，在培养结束时，将整个细胞体积从每个井转移到单独的荧光活性细胞分选或FACS管中。
用一毫升PBS洗涤每个样品，并辅以0.1%的胎儿小牛血清或FCS。将颗粒在适当的抗人 CD4 抗体中重新在 100 微升 PBS 加 FCS 中。在4摄氏度下孵育细胞20分钟，防止光线。
在孵育结束时，将样品用一毫升新鲜 PBS 加 FCS 每管清洗，然后将颗粒重新在 100 微升新鲜 PBS 加 FCS 中。在分析之前，在每个管中加入一微升的碘化丙胺，以便排除死细胞。根据淋巴细胞的向前和侧面散射区域对淋巴细胞进行门控。
要排除凋亡细胞，请将正向散射区域与碘化负细胞进行栅极化，并使用未污染的细胞为非荧光细胞设置电压基线。设置 CD4 抗体荧光和 CFSE 信号的电压，使每个荧光信号低于 1000。使用单色控制 CFSE 和 CD4 样本，使用与未污染的电池设置的电压确认每种颜色的正荧光信号。
由于CFSE和碘化丙二具有一些光谱重叠，因此调整补偿，从CFSE荧光中减去碘化荧光，直到CFSE仅样品在碘化丙胺通道中不产生信号。分析所有样本后，计算细胞分裂指数，方法是将分裂细胞的数量除以抗原刺激组的 5000 个未分裂的细胞，除以不培养的不抗原细胞中每 5000 个未分裂的细胞的均数。几乎所有捐赠者在体外刺激后都表现出对破伤风类毒素的强烈T细胞反应，因为捐赠者已经接种了疫苗，使破伤风类毒素成为有用的阳性对抗抗原。
然而，未刺激的PBMC中CD4+T细胞的增殖是最小的。在用人类亲胰岛素C-肽刺激7天后，在1型糖尿病患者外周血中可以检测到亲胰岛素C-肽特异性CD4+T细胞。PBMC受甲型流感病毒基质蛋白刺激也表现出增殖。
综合起来，这些数据表明，可以使用全长蛋白质和短合成肽进行测定。可以使用细胞分选流细胞计执行此方法的 FACS 组件。使用细胞分拣机，可以在单个细胞级别分离抗原特异性T细胞，用于下游分析。
这种方法允许在早期发病的1型糖尿病患者中发现CD4T细胞反应。利用其他方法分析这些罕见的T细胞群会带来各种技术挑战。
