Dieses Protokoll bietet eine Plattform zum Studium von CD4T-Zellreaktionen, die oft schwach und schwer zu erkennen sind. Diese Technik ermöglicht die Detektion, Aufzählung und Isolierung von CD4T-Zellen ohne Vorkenntnisse in Bezug auf die Antigendarstellung. Der Hauptvorteil ist die Analyse von CD4T-Zellen, die oft seltene Populationen sind, die mit Autoimmunerkrankungen wie Typ-1-Diabetes in Verbindung gebracht werden.
Nach Erhalt der peripheren Blutprobe von einem gesunden Spender, verdünnen Sie das Blut in PBS in mindestens ein bis zwei Verhältnis vor schichtieren 35 Milliliter Blut über 15 Milliliter Dichte Gradient medium in einem 50 Milliliter Rohr. Trennen Sie die Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation und entfernen Sie etwa 20 Milliliter der resultierenden oberen Plasmaschicht. Dann sammeln Sie die weiße Blutkörperchen Schicht unter Vorsicht, um die rote Blutkörperchen Pellet zu vermeiden und waschen Sie die Zellen dreimal in frischen PBS.
Nach dem Zählen verdünnen Sie die Zellen auf ein mal 10 bis zur sechsten peripheren mononukleären Blutzelle oder PBMC pro Milliliter PBS-Konzentration. Fügen Sie 300 Mikroliter Zellen für jede Steuerung in einzelne 10 Milliliter-Röhren ein. Nach dem Topping jeder Röhre mit PBS, Sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Zellen mit einem mal 10 bis die sechste Zelle pro Milliliter der RP5 mittlere Konzentration.
Dann Platte 100 Mikroliter Zellen pro Kontrolle zu jedem von drei Brunnen einer 96 Brunnenplatte mit 100 Mikroliter RP5 Medium pro Brunnen. Legen Sie die Platte sieben Tage lang in den Zellkultur-Inkubator. Als nächstes übertragen Sie die verbleibenden PBMCs in eine neue 50-Milliliter-Röhre und fügen Sie einen Mikroliter CFSE-Arbeitsstofflösung pro Milliliter Zellsuspension an die Seite des Rohres.
Um die Röhre mehrmals schnell umzukehren, um die Zellen für fünf Minuten in einen Zellkultur-Inkubator zu mischen und zu platzieren. Am Ende der Inkubation, halten Sie die Reaktion mit fünf Milliliter RP5 Medium und sammeln die Zellen durch Zentrifugation. Setzen Sie das Pellet einmal 10 bis sechs PBMCs pro Milliliter frisches RP5-Medium aus und fügen Sie einem zu prüfenden 10 Milliliter-Röhrchen pro zu prüfendem Antigen einen Milliliter Zellen hinzu.
Dann fügen Sie 100 Mikroliter Zellen pro Antigen zu jedem von drei Brunnen einer 96 Well Platte gut enthält 100 Mikroliter RP5 Medium mit dem verdünnten Antigen von Interesse pro Brunnen ergänzt. Legen Sie die Platte sieben Tage lang in den Zellkultur-Inkubator. Um die CD4+T-Zellpopulationen für die strömungszytometrische Analyse zu färben, übertragen Sie am Ende der Kultur das gesamte Volumen der Zellen von jedem Brunnen in einzelne fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder FACS-Röhren.
Waschen Sie jede Probe mit einem Milliliter PBS, ergänzt mit 0,1% fetalem Kalbsserum oder FCS. Setzen Sie die Pellets in einem geeigneten antihumanen CD4-Antikörper in 100 Mikroliter PBS plus FCS pro Tube aus. Inkubieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius für 20 Minuten vor Licht geschützt.
Am Ende der Inkubation die Proben in einem Milliliter frischer PBS plus FCS pro Tube waschen und die Pellets in 100 Mikroliter frischer PBS plus FCS wieder aufhängen. Unmittelbar vor der Analyse, fügen Sie einen Mikroliter Propidiumiodid zu jeder Röhre, um den Ausschluss von abgestorbenen Zellen zu ermöglichen. Gate die Lymphozyten nach ihren vorderen und seitlichen Streubereichen.
Um die apoptotischen Zellen auszuschließen, richten Sie den vorderen Streubereich im Vergleich zu Propidiumjodid-negativen Zellen und verwenden die nicht befleckten Zellen, um eine Spannungsbasislinie für die nicht fluoreszierenden Zellen festzulegen. Stellen Sie die Spannungen für den CD4-Antikörper Fluorophor und das CFSE-Signal so ein, dass das Fluoreszenzsignal für jeden unter 1000 liegt. Verwenden Sie die einzelnen Farbsteuerungs-CFSE- und CD4-Samples, um ein positives Fluoreszenzsignal für jede Farbe mithilfe der mit den unbefleckten Zellen eingestellten Spannungen zu bestätigen.
Da CFSE und Propidiumjodid einige spektrale Überlappung haben, passen Sie die Kompensation an, um die Propidiumiodidfluoreszenz von der CFSE-Fluoreszenz zu subtrahieren, bis die einzige CFSE-Probe kein Signal im Propidium-Iodid-Kanal liefert. Wenn alle Proben analysiert wurden, berechnen Sie den Zellteilungsindex, indem Sie die Anzahl der geteilten Zellen durch 5000 ungeteilte Zellen aus der antigen stimulierten Gruppe durch die mittlere Anzahl geteilter Zellen pro 5000 ungeteilte Zellen aus den Zellen dividieren, die ohne Antigen kultiviert werden. Fast alle Spender zeigen eine starke T-Zell-Reaktion auf Tetanus-Toxoid nach In-vitro-Stimulation, da die Spender geimpft wurden, was Tetanus Toxoid zu einem nützlichen Positivkontrollantigen macht.
Die Proliferation von CD4+T-Zellen aus nicht stimulierten PBMCs ist jedoch minimal. Nach sieben Tagen Stimulation mit humanem Proinsulin C-Peptid können Pro-Insulin C-Peptid-spezifische CD4+T-Zellen im peripheren Blut eines Patienten mit Typ-1-Diabetes nachgewiesen werden. PBMC stimuliert mit Influenza-A-Virusmatrix-Protein zeigt ebenfalls eine Proliferation.
Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass der Test mit Vollwertproteinen sowie kurzen synthetischen Peptiden durchgeführt werden kann. Die FACS-Komponente dieser Methode kann mit einem Zellsortierdurchflusszytometer durchgeführt werden. Mit einem Zellsortierer können die antigenspezifischen T-Zellen auf Einzelzellebene für die nachgeschaltete Analyse isoliert werden.
Diese Methode hat die Entdeckung von CD4T-Zellreaktionen bei Personen mit frühem Typ-1-Diabetes ermöglicht. Die Analyse dieser seltenen T-Zellpopulationen unter Verwendung anderer Methoden stellt verschiedene technische Herausforderungen dar.
