Este protocolo fornece uma plataforma para estudar respostas de células CD4T que muitas vezes são fracas e difíceis de detectar. Esta técnica permite a detecção, enumeração e isolamento de células CD4T sem conhecimento prévio sobre apresentação de antígeno. A principal vantagem é a análise de células CD4T que são populações bastante raras associadas a condições autoimunes, como diabetes tipo um.
Ao obter a amostra de sangue periférica de um doador saudável, dilui o sangue em PBS em pelo menos uma ou duas proporções antes de colocar em camadas 35 mililitros de sangue acima de 15 mililitros de média gradiente de densidade em um tubo de 50 mililitros. Separe as células por centrifugação gradiente de densidade e remova aproximadamente 20 mililitros da camada de plasma superior resultante. Em seguida, colete a camada de glóbulos brancos tomando cuidado para evitar a pelota de glóbulos vermelhos e lave as células três vezes em PBS fresco.
Após a contagem, dilui as células para uma única vez 10 a sexta célula mononuclear de sangue periférica ou PBMC por mililitro de concentração de PBS. Adicione 300 microliters de células para cada controle em tubos individuais de 10 mililitros. Depois de cobrir cada tubo com PBS, sedimentar as células por centrifugação e resuspencar as células em uma única vez 10 para a sexta células por mililitro de concentração média RP5.
Em seguida, a placa 100 microliters de células por controle para cada um dos três poços de uma placa de 96 poços contendo 100 microliters de RP5 médio por poço. Coloque a placa na incubadora de cultura celular por sete dias. Em seguida, transfira os PBMCs restantes para um novo tubo de 50 mililitros e adicione um microliter de solução de estoque de trabalho CFSE por um mililitro de suspensão celular para a lateral do tubo.
Inverta rapidamente o tubo várias vezes para misturar e colocar as células em uma incubadora de cultura celular por cinco minutos. No final da incubação, prenda a reação com cinco mililitros de RP5 médio e colete as células por centrifugação. Resuspenque a pelota em uma vez 10 a 10 para o sexto PBMCs por mililitro de meio RP5 fresco e adicione um mililitro de células a um tubo de 10 mililitros por antígeno a ser testado.
Em seguida, adicione 100 microliters de células por antígeno a cada um dos três poços de uma placa de 96 poços contendo 100 microliters de RP5 médio suplementado com o antígeno diluído de interesse por poço. Coloque a placa na incubadora de cultura celular por sete dias. Para colorar as populações de células CD4+T para análise citométrica de fluxo, no final da cultura transfira todo o volume de células de cada poço para fluorescência individual ativada de triagem celular ou tubos FACS.
Lave cada amostra com um mililitro de PBS suplementado com soro de bezerro fetal de 0,1% ou FCS. Resuspend as pelotas em um anticorpo CD4 anti-humano apropriado em 100 microliters de PBS mais FCS por tubo. Incubar as células a quatro graus Celsius por 20 minutos protegidos da luz.
No final da incubação, lave as amostras em um mililitro de PBS fresco mais FCS por tubo e resuspenja as pelotas em 100 microliters de PBS fresco mais FCS. Imediatamente antes da análise, adicione um microliter de iodeto de propidium a cada tubo para permitir a exclusão de células mortas. Portão os linfócitos de acordo com suas áreas de dispersão dianteira e lateral.
Para excluir as células apoptóticas, portão a área de dispersão dianteira versus células negativas de iodeto de propídio e use as células não manchadas para definir uma linha de base de tensão para as células não fluorescentes. Defina as tensões para o fluorophore de anticorpos CD4 e o sinal CFSE para que o sinal fluorescente fique abaixo de 1000 para cada um. Use as amostras de controle de cor única CFSE e CD4 para confirmar um sinal fluorescente positivo para cada cor usando as tensões definidas com as células não manchadas.
Como cfse e iodida de propídio têm alguma sobreposição espectral, ajuste a compensação para subtrair a fluorescência de iodida de propídio da fluorescência CFSE até que a amostra apenas de CFSE não produza um sinal no canal de iodeto de propídio. Quando todas as amostras tiverem sido analisadas, calcule o índice de divisão celular dividindo o número de células divididas por 5000 células não divididas do grupo estimulado pelo número médio de células divididas por 5000 células não divididas das células cultivadas sem antígeno. Quase todos os doadores demonstram uma forte resposta de células T ao toxóide de tétano após estimulação in vitro porque os doadores foram vacinados fazendo do tétano toxóide um antígeno de controle positivo útil.
No entanto, a proliferação de células CD4+T de PBMCs não estimulados é mínima. Após sete dias de estimulação com c-peptídeo pró-insulina humana, células CD4+T específicas pró-insulina C-peptídeos podem ser detectadas no sangue periférico de um indivíduo com diabetes tipo um. PBMC estimulado com influenza A proteína matricial do vírus também demonstra proliferação.
Juntos, esses dados demonstram que o ensaio pode ser realizado utilizando proteínas de comprimento total, bem como peptídeos sintéticos curtos. O componente FACS deste método pode ser realizado usando um citómetro de fluxo de classificação celular. Usando um classificador de células, as células T específicas do antígeno podem ser isoladas no nível de célula única para análise a jusante.
Este método permitiu a descoberta de respostas de células CD4T em indivíduos com diabetes tipo um de início precoce. Analisar essas raras populações de células T utilizando outros métodos apresenta vários desafios técnicos.
