Bu protokol, genellikle zayıf ve algılanması zor CD4T hücre yanıtlarını incelemek için bir platform sağlar. Bu teknik, antijen sunumu ile ilgili önceden bilgi sahibi olmadan CD4T hücrelerinin algılanmasına, numaralandırmasına ve izolasyonuna olanak sağlar. Ana avantajı tip bir diyabet gibi otoimmün koşullar ile ilişkili oldukça sık nadir popülasyonlar CD4T hücrelerinin analizidir.
Sağlıklı bir donörden periferik kan örneği aldıktan sonra, 50 mililitrelik bir tüpte 15 mililitrelik yoğunluk gradyan ortamının 35 mililitresini katmanlamadan önce PBS'deki kanı en az bir ila iki oranda seyreltin. Yoğunluk gradyan santrifüj ile hücreleri ayırın ve ortaya çıkan üst plazma tabakasının yaklaşık 20 mililitre çıkarın. Sonra kırmızı kan hücresi pelet önlemek için özen alarak beyaz kan hücresi tabakası toplamak ve taze PBS hücreleri üç kez yıkayın.
Sayma sonra, pbs konsantrasyonu mililitre başına altıncı periferik kan mononükleer hücre veya PBMC bir kez 10 hücreleri seyreltmek. Tek tek 10 mililitre tüpler içine her kontrol için hücrelerin 300 mikrolitre ekleyin. PBS ile her tüp tepesi sonra, santrifüj ile hücreleri tortu ve RP5 orta konsantrasyon mililitre başına altıncı hücrelere bir kez 10 hücreleri askıya.
Daha sonra, kuyu başına 100 mikrolitre RP5 orta içeren 96 kuyunun üç kuyunun her birine kontrol başına 100 mikrolitre hücre plakası koyun. Plakayı yedi gün boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Daha sonra, kalan PBMC'leri yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın ve bir mililitre hücre süspansiyonu başına bir mikrolitre CFSE çalışma stok çözeltisi ekleyin.
Hızlı bir şekilde karıştırmak ve beş dakika boyunca bir hücre kültürü kuluçka hücreleri yerleştirmek için tüp birkaç kez ters. Kuluçka sonunda, RP5 orta beş mililitre ile reaksiyon tutuklama ve santrifüj ile hücreleri toplamak. Taze RP5 orta mililitre başına altıncı PBMCs bir kez 10 pelet resuspend ve test edilecek antijen başına bir 10 mililitre tüp hücrelerin bir mililitre ekleyin.
Sonra iyi başına ilgi seyreltilmiş antijen ile desteklenen RP5 orta 100 mikrolitre içeren bir 96 iyi plaka iyi üç kuyuher üç kuyubaşına antijen başına hücrelerin 100 mikrolitre ekleyin. Plakayı yedi gün boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Akış sitometrik analizi için CD4+T hücre popülasyonlarını lekelemek için, kültürün sonunda her bir kuyudan tüm hücre hacmini ayrı floresan aktif hücre sıralamaveya FACS tüplerine aktarın.
Her numuneyi %0,1 fetal baldır serumu veya FCS ile desteklenen bir mililitre PBS ile yıkayın. Tüp başına 100 mikrolitre PBS artı FCS uygun bir anti-insan CD4 antikor pelet resuspend. Hücreleri ışıktan korunan 20 dakika boyunca 4 derecede kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sonunda, numuneleri bir mililitre taze PBS artı fcs tüp başına yıkayın ve 100 mikrolitre taze PBS artı FCS'de peletleri yeniden askıya alın. Analizden hemen önce, ölü hücrelerin dışlanmasına izin vermek için her tüpe bir mikrolitre propidium iyodür ekleyin. Lenfositleri ileri ve yan dağılım alanlarına göre kaplar.
Apoptotik hücreleri dışlamak için, propidium iyodür negatif hücrelere karşı ileri dağılım alanını kapamave floresan olmayan hücreler için bir gerilim taban çizgisi ayarlamak için lekelenmemiş hücreleri kullanın. CD4 antikor florofor ve CFSE sinyalinin gerilimlerini, floresan sinyalin her biri için 1000'in altında olacak şekilde ayarlayın. Lekelenmemiş hücrelerle ayarlanan gerilimleri kullanarak her renk için pozitif floresan sinyali doğrulamak için tek renk kontrolü CFSE ve CD4 örneklerini kullanın.
CFSE ve propidium iyodür bazı spektral çakışma var gibi, CFSE sadece örnek propidium iyodür kanalında bir sinyal verim iyodür kadar CFSE floresan propidium iyodür floresan çıkarmak için tazminat ayarlayın. Örneklerin tümü analiz edildiğinde, bölünen hücre sayısını, antijen olmayan 5000 bölünmemiş hücre başına bölünen hücre sayısına göre, uyarılmış antijen grubundan 5000 bölünmemiş hücreye bölerek hücre bölünmesi indeksi hesaplayın. Hemen hemen tüm donörler in vitro stimülasyon sonra Tetanos toksoid güçlü bir T-hücre yanıtı göstermek çünkü donörler Tetanoz toksoid yararlı bir pozitif kontrol antijeni yapma aşı edilmiştir.
Ancak, uyarılmamış PBMC'lerden CD4+T hücrelerinin çoğalması çok azdır. İnsan pro-insülin C-peptid ile stimülasyon yedi gün sonra, pro-insülin C-peptid spesifik CD4 + T hücreleri tip bir diyabetli bir bireyin periferik kan tespit edilebilir. PBMC influenza ile uyarılmış A virüs matris proteini de çoğalma gösterir.
Birlikte ele alındığında, bu veriler, tam uzunlukta proteinlerin yanı sıra kısa sentetik peptidler kullanılarak da yapIlebilmektedir. Bu yöntemin FACS bileşeni bir hücre sıralama akış sitometresi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bir hücre ayırıcısı kullanarak, antijene özgü T-hücreleri downstream analizi için tek hücre düzeyinde izole edilebilir.
Bu yöntem erken başlangıçlı tip bir diyabet olan bireylerde CD4T hücre yanıtlarının keşfi için izin verilmiştir. Bu nadir T-hücre popülasyonlarının diğer yöntemleri kullanarak analiz etmek çeşitli teknik zorluklar sunmaktadır.
