液滴数字 TRAP (ddTRAP): 对端粒重复放大协议的适应性, 以实现液滴数字聚合酶链反应

ddTRAP测定提供了对细胞中端粒酶活性进行敏感、可靠和高度定量测量的能力。以中等吞吐量的方式，每运行最多运行 96 个样本，这为我们提供了极大的优势。我们可以运行控件和复制，以对收集的数据进行适当的统计分析。

在细胞解解之前，立即解冻NP-40解液缓冲液的冷冻等分。解冻后，将解液缓冲液放在冰上。将PMSF蛋白酶抑制剂加入NP-40解液缓冲液，最终浓度达到0.2毫摩尔。

然后，将40微升的解液缓冲液加入含有细胞颗粒的管子中，达到每微升25，000个细胞的细胞等效性。轻轻移液，上下移液，以打破打开细胞。尽量避免冒泡。

让细胞在冰上融化30分钟。每10分钟轻轻旋转一次落酸，防止细胞碎片团的形成。在细胞解解过程中，在微离心管中准备端粒酶延伸反应的主混合物，并储存在冰上。

细胞解解后，移液器48微升的延长主混合到每个PCR管中。在每个PCR管中加入两个稀释的利沙酸微升，以达到每微升50个细胞的最终细胞等效性，并根据手稿继续端粒酶延伸反应。在微离心管中为 ddTRAP 准备主混合物，并在室温下保持。

移液 19.8 微升 ddPCR 主混合到每个 PCR 管中。在每个管中加入2.2微升以前的延长反应溶液，使总体积为22微升。要设置液滴生成盒，首先将 20 微升的制备溶液装入墨盒的中间样品中。

轻轻敲击墨盒的侧面，将任何气泡移动到溶液顶部。在装油之前，墨盒的所有孔都必须装入样品。然后，将70微升液滴生成油装入左油井。

通过将垫片固定到墨盒的末端，将垫片固定到位，然后将已加载和组装的弹夹放入液滴发生器中。发电机显示一个坚实的绿灯，以通知墨盒是否正确放置。60 到 90 秒后，当发电机指示灯停止闪烁时，循环完成。

现在取出墨盒。轻轻地从墨盒中取出垫片。使用多通道移液器将来自右侧井的新产生的液滴的大约 40 微升移液器移液到 96 井 PCR 板中。

将所有样品装入 96 井板后，用铝箔 PCR 板密封加热密封板，以防止蒸发。然后，将 96 井板装入热循环器以执行 PCR 反应。首先，将 96 井板加载到液滴读卡器中。

正确定向板，使 A1 样品与支架样品匹配。打开与液滴读取器关联的软件。双击第一个井 A01，打开样品井编辑器屏幕。

单击"实验"，然后从下拉菜单中选择要使用的检测类型。选择 QX200 ddPCR EvaGreen 超级混合作为正确的检测方法。单击井编辑器屏幕右下角的"应用"，将用户定义的设置保存到所有突出显示的井中。

接下来，单击井编辑器屏幕中的 Target，然后单击"目标"下拉菜单以选择未知、引用或无模板控件以定义示例类型。在"示例名称"部分中，标记所有示例并单击"应用"。单击"运行"可读取板。

当提示通知应读取板的方向时，选择"运行选项"屏幕中的"列"或"行"。通过双击单个孔或列和行标题以提供信息表，确定每个样品的接受液滴数。对于 ddTRAP，具有 10，000 个或更多接受液滴的样品是有效的，可以进行进一步分析。

突出显示表示样本复制和 NTC 样本的孔。通过单击图标在屏幕左下角设置阈值，手动设置样本的阈值。在该协议中，端粒酶活性在细胞面板中测量，该细胞组由9个肺癌细胞系和端粒酶阴性成纤维细胞组成。

SHP77、H2887和NTC的所有三种生物复制的荧光振幅设定在2000个左右。正液滴的荧光强度在6000个荧光振幅左右，在顶部形成清晰的群体，与负液滴在1，100个荧光振幅之间分离。所有样本之间每个细胞的端粒酶延长产品总端粒酶延伸产品是根据核酸的测量浓度估算的，核酸代表肺癌系中的端粒酶活性。

在解解或延伸反应步骤期间的任何RNase污染都会破坏端粒酶酶活性，因为它是核糖核酸蛋白复合物。ddtrap 可以在细胞中的 htert mRNA 表达水平上与 ddPCR 跟进。这两个数据集使我们能够将 hTERT 的表达与端粒酶活性关联，并更深入地挖掘潜在的端粒酶调控机制，如替代拼接。

我们可以探讨对特定拼接因子的操纵及其对端粒酶活性的影响。目前，我们正在设计寡核苷酸拼接调制器作为针对端粒酶活性的潜在药物。