评估下肢缺血的Murine模型的治疗血管生成

本实验的总体目标是，我们的后肢缺血模型是为实验照亮基础，全面评估肿瘤制剂的功能、组织学和分子效应。该协议为在小型动物模型中测试可能的血管生成疗法提供标准，具有未来在临床环境中应用的潜力。由于再血管化不适合20%至30%的危重缺血患者治疗血管生成已成为改善缺血场血流血的新策略。

该实验协议可以全面了解血管原疗法在衡量其每次结果的疗效时所施加作用的机制。在确认一只22周大的C57黑色六只雌性小鼠对脚趾捏紧缺乏反应后，从右后肢剃光头发，将动物固定在加热垫上。将动物放在解剖显微镜下。

并使用11号手术手术手术刀刀片，使一厘米的皮肤切口在右后肢的大腿上。模糊解剖皮下脂肪，以暴露神经血管束。并使用尖钳、弹簧剪刀和眼皮针架打开膜状异体护套，以暴露外层和股骨血管。

解剖动脉和静脉后，使用7个O不可吸收的聚丙烯缝合线来连接远端股动脉和静脉以及远外肠动脉和静脉。识别出深外腹动脉以及直肠外腹动脉和股动脉和静脉的结扎和切除是手术成功的关键。使用弹簧剪刀在近位结和近结之间横穿静脉的静脉。

用可吸收的缝合线关闭切口。然后，将抗毒溶液进行跨体向动物提供，然后将鼠标返回到其家庭笼子进行监测，直到完全恢复。要收获胃部肌肉，请从两个后肢上去除皮肤。

并使用棉签将皮肤与肌肉分开。握住跟腱，用弹簧剪刀将肌肉从头骨和腓骨分离到膝盖关节。将二头肌与胃肌分开。

使用弹簧剪刀切割膝关节水平的胃关节肌肉的插入。并使用 10%三气松将收获的肌肉以横向方向定位在小软木盘上。然后，在液氮冷却异丙烷中捕捉冻结样品，以储存零下80摄氏度。

对于毛细管微切除激光捕获，在获得12微米部分的肌肉标本后，将组织固定到50毫升冷却的纯丙酮的幻灯片上，在零下20摄氏度下5分钟。空气干燥后，用疏水笔圈出每个试样。并在4摄氏度的PBS中用两个摩尔氯化钠对样品进行补水。

在补水结束时，在四摄氏度的温度下标记样品，并贴上适当的原抗体。接着是每次洗涤的新鲜两个摩尔氯化钠洗涤两次三分钟。第二次洗涤后，在四摄氏度下用适当的二级抗体标记各部分三十分钟，随后在PBS中用氯化钠洗两次，如所证明的。

接下来，在四摄氏度下，用阿维丁结合过氧化物酶复合物标记样品30分钟。接着是用DAB过氧化物酶基板洗涤和五分钟贴标。在孵育结束时，在连续的冰冷90%乙醇和100%乙醇的 emions 中脱水组织。

然后，使用后来的微解系统，配备脉冲到固态355纳米激光，每只小鼠解剖1万个毛细血管，将解剖毛细管弹射到微模糊管胶粘盖中。如图所示，在后肢缺血诱导后立即观察到后肢灌注的完全丧失。对血流的定量评估，以 ISC 与 NISC 肢体的比例表示，表明在 HLI 后第 15 天和 45 天接触亲血管刺激的小鼠中，肢体血液灌注显著增加。

胃细胞肌肉组织部分CD31阳性毛细血管的定量表明，缺血性肢体的毛细管密度大于非缺血性肢体。如预期的那样。但这种效果在用亲血管原剂治疗后进一步放大。

辅助血管密度在缺血肢体中也持续增加，在接触亲血管刺激后，这种增加显著增加。CD31阳性内皮细胞中亲血管基因表达的逆转录酶聚合酶链反应分析表明，暴露或不接触亲血管生成剂的小鼠之间的基因表达存在明显变异。重要的是使用老年眼科针打开膜瘤护套，以避免在血管解剖期间撕裂动脉和静脉。

在激光多普勒基于灌注测量的随从评估中，容器对后肢缺血作出反应，毛细血管密度的组织学定量使我们能够评估血管生成。